大豆蚜熱休克蛋白70基因的克隆、原核表達與定量分析.pdf

1、熱休克蛋白Hsps(Heat shock proteins)是一類極度保守的應激蛋白，廣泛地參與細胞的保護。目前，Hsp70家族被廣泛認為是最為保守和重要的熱休克蛋白家族。在脅迫環(huán)境下，如重金屬、低氧、高溫、饑餓、病原的入侵等的刺激下，Hsp70的表達量顯著增加。熱休克蛋白的高度表達能增強昆蟲對外界脅迫因子的抵御能力，對昆蟲機體維持細胞結構的完整性和正常新陳代謝有著非常重要的作用。通過分子生物學技術使害蟲熱休克蛋白的表達量降低，來減弱有

2、害昆蟲對外界不利環(huán)境的防御能力，從而達到協(xié)助殺滅害蟲的目的。通過分子生物學技術使害蟲熱休克蛋白的表達量降低，來減弱有害昆蟲對外界不利環(huán)境的防御能力，從而達到協(xié)助殺滅害蟲的目的。
　　 大豆蚜(Aphis glycines Matsumura)屬于半翅目(Hemiptera)、同翅類(Homoptera)、蚜科(Aphididae)、蚜屬(Aphis)，是危害栽培大豆(Glycine max)最為主要的害蟲之一，極大影響著大豆的品

3、質(zhì)和產(chǎn)量。目前，國內(nèi)外尚未專門針對Hsp70蛋白對大豆蚜進行防治研究。本文通過RT-PCR及RACE技術克隆得到大豆蚜熱休克蛋白70基因（Hsp70與Hsc70），成功構建表達載體，進行原核表達，獲得大豆蚜Hsp70重組蛋白。并單頭提取各溫度熱激條件下的大豆蚜RNA，進行實時熒光定量PCR分析。為今后研究大豆蚜在受到熱脅迫后熱休克蛋白70的表達規(guī)律及熱控技術防治害蟲提供依據(jù)。
　　 本研究以大豆蚜{Aphis glycines

4、Matsumura)為材料，分別提取總RNA，利用RT-PCR和RACE技術，分別擴增得到大豆蚜的Hsp70基因與Hsc70基因的全長cDNA序列。并利用大腸桿菌pET21b表達系統(tǒng)對二者進行了原核表達，得到重組融合蛋白。
　　 本研究克隆了大豆蚜Hsc70 cDNA的全長的序列:這個序列含2281個堿基，其內(nèi)部包含一個1965個堿基的開放閱讀框，能夠編碼一個含654個氨基酸殘基的蛋白，分子量大小為71.41kDa，等電點pI:

5、5.22。大豆蚜Hsc70基因含兩個典型的Hsp70家族的簽名序列:1DLGTTYS（11～18殘基）殘基，IFDLGGGTFDVSIL（199～212殘基）。推導的氨基酸序列中存在6個N位糖基化位點。利用SignalP4.0 Server軟件分析后，結果表明:ORF核苷酸序列內(nèi)的18～19位為信號肽切割位點。在GenBank上大豆蚜登錄Hsc70的基因序列，獲得登錄號: KF052087。
　　 克隆了大豆蚜Hsp70 cDN

6、A全長序列:這個序列含2268個堿基，其中包括一個1962個堿基的開放閱讀框，能夠編碼一個含653個氨基酸殘基的蛋白，分子量大小為71.22 kDa，等電點pI:5.43。大豆蚜Hsp70基因含三個Hsp70家族的簽名序列:IDLGTTYS（10～17殘基），IFDLGGGTFDVSIL（198～211殘基），IVLVGGSTRIPK（335～349殘基）。推導的氨基酸序列中存在6個N位糖基化位點。利用SignalP4.0 Server

7、軟件分析后，結果表明:ORF核苷酸序列內(nèi)的17～18位為信號肽切割位點。在GenBank上大豆蚜登錄Hsp70的基因序列，獲得登錄號:JQ340173。
　　 研究結果表明:大豆蚜Hsp70與Hsc70基因均含20種相同種類氨基酸，且各類氨基酸含量基本相同，均富含甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、賴氨酸Lys。昆蟲熱休克蛋白Hsp70作為一種糖蛋白，糖基化是酶活化的重要因素之一。利用NetOGlyc2.0軟件發(fā)現(xiàn)在大豆蚜Hsp70氨基

8、酸序列和Hsc70氨基酸序列中均有6個糖基化位點，除N-位糖基化位點以外，昆蟲熱休克蛋白Hsp70的氨基酸序列內(nèi)含有很多硫酸化與磷酸化的位點，利用Expasy分子生物學服務器上的Prosite軟件能夠找到這些硫酸化與磷酸化位點，蛋白功能的發(fā)揮受到這些位點的調(diào)控。
　　 通過氨基酸序列一致性比較分析，可以明顯的看出，大豆蚜Hsp70/Hsc70與其他昆蟲Hsp70基因的氨基酸序列的相似度均在90％以上。
　　 分別重組大豆

9、蚜Hsp70/Hsc70基因至pET21b載體內(nèi)，在聚丙烯酰胺凝膠的電泳檢測后，都能夠檢測出目的融合蛋白。經(jīng)Western blot分析后，結果表明:重組質(zhì)粒pET/Hsp70的原核表達結果與預期結果相符，確為大豆蚜Hsp70基因的表達。
　　 利用Real time PGR技術，對不同溫度脅迫下大豆蚜Hsp70與Hsc70表達水平進行相對定量分析表明:大豆蚜在25～37℃范圍內(nèi)，其Hsp70表達量隨溫度升高而上升，37℃時達到