核轉(zhuǎn)錄因子-kBC-Rel亞基克隆及C-Rel-P65-P50對豬偽狂犬病毒在BHK21細胞上增殖的影響.pdf

1、細胞核因子-1κB(Nuclear factorκappa B)是一種較特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，普遍存在于真核細胞內(nèi)，對宿主先天性免疫反應及細胞增殖、分化和凋亡起到關鍵的調(diào)節(jié)作用。細胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB可以通過調(diào)控相關靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達，參與機體的多種生理活動，當機體感染細菌或病毒等致病因素，其信號通路將在一系列酶的作用下被激活，參與宿主的免疫應答，它的異常活化可能是PRV導致免疫抑制的重要原因。為獲得豬NF-κB C-Rel亞基序列特性，對

2、PRV感染導致的免疫抑制與NF-κB表達異常的關聯(lián)性進行研究，本試驗通過NCBI GeneBank中豬核轉(zhuǎn)錄因子-κB C-Rel亞基序列（XM_003125115）設計特異性引物，對NF-κBC-Rel全序列進行克隆、序列鑒定及生物信息學分析;對PRV感染PK-15細胞對C-Rel轉(zhuǎn)錄時相的影響進行分析;并構(gòu)建NF-κB C-Rel真核表達載體，對NF-κBC-Rel亞基真核表達產(chǎn)物對PRV復制的影響進行探討，結(jié)果如下:
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3、.豬核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB C-Rel亞基的克隆及序列鑒定本實驗采用RT-PCR方法從豬外周血淋巴細胞中擴增到NF-κB C-Rel ORF區(qū)并克隆至pMD19-T simple vector，克隆獲得陽性質(zhì)粒后測序，進行相關生物信息學分析。序列分析結(jié)果表明:所擴增豬C-Rel亞基ORF長1773 bp，編碼590 aa;豬C-Rel核苷酸序列與不同動物的C-Rel核苷酸序列相似性較高;大部分位于細胞核(76.0％)內(nèi)，無信號肽及跨膜區(qū)。

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　　2.PRV感染PK-15細胞對NF-κB C-Rel亞基mRNA轉(zhuǎn)錄時相的影響分析本實驗成功構(gòu)建了NF-κB C-Rel亞基基因的熒定量檢測方法;運用此方法對PK-15細胞感染PRV后，不同時段的細胞中C-Rel亞基mRNA轉(zhuǎn)錄情況進行測定并分析。結(jié)果表明:標準品拷貝數(shù)在一定的濃度范圍內(nèi)有極好的線性關系，相關系數(shù)達到0.998，擴增效率為103.8％;特異性強，擴增產(chǎn)物形成單一的特異性融解峰;靈敏性高，能檢出102copie

5、s/ul的標準質(zhì)粒;重復性好，組內(nèi)變異系數(shù)較小。PK-15感染PRV后，與對照組相比:0～4h，C-Rel轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，在2 h和4h差異顯著(P＜0.05);4～12h，C-Rel轉(zhuǎn)錄水平快速上調(diào)，12h達到轉(zhuǎn)錄高峰(P＜0.01);12 h后C-Rel轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降，24～120 h，均維持在較低水平，其中36h差異極顯著(P＜0.01)，48 h，72 h和120 h差異顯著(P＜0.05)?？梢姡琍RV的感染會導致PK-15細

6、胞中NF-κB活化水平的降低，這與目前的相關研究結(jié)果基本相符。
　　3.豬NF-κappaB C-Rel亞基真核表達載體的構(gòu)建及C-Rel/P50/P65轉(zhuǎn)染BHK21細胞對PRV增殖的影響本實驗為了研究不同NF-κB(C-Rel/P65/P50)對PRV增殖的影響，成功構(gòu)建了pCDNA3.1(+)-C-Rel真核表達載體，與本實驗室已構(gòu)建的P50，P65真核表達載體兩兩組合，應用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK21細胞，C-Rel、P50、P

7、65亞基的表達水平通過Westem-blot法被成功檢測;將pCDNA3.1(+)空載體、pCDNA3.1(+)-C-Rel、pCDNA3.1(+)-C-Rel+pCDNA3.1(+)-P65、pCDNA3.1(+)-C-Rel+pCDNA3.1(+)-P50-RHD分別轉(zhuǎn)染至BHK21細胞，轉(zhuǎn)染14h后接種PRV，應用本實驗構(gòu)建的PRV gE基因熒光定量PCR方法，對細胞上清中病毒粒子增殖時相進行檢測，繪制PRV一步生長曲線。本實驗成

8、功構(gòu)建了豬pCDNA3.1(+)-C-Rel真核表達載體，且能夠在BHK21細胞中表達;轉(zhuǎn)染C-Rel/C-Rel、C-Rel/P50-RHD、C-Re/P65真核表達質(zhì)粒均能促進細胞病變的提前出現(xiàn);由各轉(zhuǎn)染組PRV一步生長曲線結(jié)果可知，C-Rel/C-Rel、C-Rel/P65能有效減緩PRV在BHK21細胞上增殖的進程，其中，C-Rel/P65的抑制作用更強?？梢?，NF-κB C-Rel/C-Rel、C-Rel/P65二聚體能在一定