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文檔簡介
1、研究背景
癌癥極大地危害著人類的生命健康,化學(xué)藥物治療仍是目前腫瘤治療的主要手段。而腫瘤針對性較強(qiáng)的化學(xué)藥物治療將成為腫瘤治療的主攻方向。結(jié)腸癌是高發(fā)病率且高死亡率的惡性腫瘤之一,找到一種有效、作用特異的化學(xué)治療藥物是非常必要的。PTEN是一新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,但其確切的作用機(jī)制以及作用信號通路仍在研究之中。研究發(fā)現(xiàn),PTEN在結(jié)腸癌的形成及致癌過程中起著關(guān)鍵的作用。
化合物5-[2,3-
2、二氯-4-(2-亞甲基-1-代丁基)氯苯]-3-甲基-1,2,4-噁二唑(6r)是含有噁二唑基團(tuán)的依他尼酸(EA)的衍生物。前期研究表明,6r能在體外、體內(nèi)抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡,例如6r能有效的抑制人前列腺癌、骨髓性白血病、人宮頸癌、結(jié)腸癌等,提示其具有較好的抗腫瘤活性。本課題選4種不同的人結(jié)腸癌細(xì)胞株,深入探討化合物6r抑制人結(jié)腸癌增殖的作用機(jī)制及其抗增殖作用與人結(jié)腸癌細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平的相關(guān)性。
實驗方法
3、r> 首先,采用MTT法檢測6r對4種人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、SW620、HCT116和Lovo生長的抑制作用。Westernblotting法檢測4種細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)水平及6r對PTEN表達(dá)水平的影響。
其次,考察化合物6r對PTEN介導(dǎo)的信號通路的影響。采用FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法檢測6r對HT29和HCT116細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用;碘化丙啶(PI)單染法檢測6r對HT29和HCT116細(xì)胞周期的影響。劃痕
4、試檢測6r對HT29細(xì)胞遷移能力的影響。Westernblotting法檢測6r對HT29、SW620和HCT116細(xì)胞中PI3K、P-AKT、MDM2及P53蛋白表達(dá)水平的影響。
最后,觀察PTEN抑制劑VO-OHpic是否能抑制6r對PTEN介導(dǎo)的下游信號通路的影響及對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的抑制作用。采用MTT法檢測VO-OHpic存在時6r對HT29和HCT116細(xì)胞生長的抑制作用。臺盼藍(lán)染色法檢測在VO-OHpic作用下6r
5、對HT29和HCT116細(xì)胞的毒性作用。Westernblotting法檢測在VO-OHpic作用下6r對HT29和HCT116細(xì)胞內(nèi)P-AKT和P53蛋白表達(dá)的影響。
實驗結(jié)果
1化合物6r對結(jié)腸癌細(xì)胞的抗癌效應(yīng)與PTEN有關(guān)
MTT結(jié)果顯示,6r對3種結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29和SW620的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用,對Lovo細(xì)胞抑制作用較弱。Westernblotting結(jié)果顯示在無6r存在時,H
6、CT116、HT29、SW620和Lovo細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平依次降低;而在化合物6r作用下,HCT116、HT29、SW620和Lovo四種細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)水平明顯增加,且具有劑量依賴性。
26r通過激活PTEN介導(dǎo)的下游通路抑制結(jié)腸癌的生長
FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法試驗結(jié)果顯示,2、4、6μM三個濃度的6r處理HT29和HCT116細(xì)胞48h,細(xì)胞凋亡率逐漸增加。PI單染法試驗結(jié)果顯示,
7、2、4、6μM6r處理HT29和HCT116細(xì)胞48h,處于S期的細(xì)胞數(shù)比例顯著增加,證明6r可阻滯HT29和HCT116細(xì)胞周期于S期。劃痕試驗結(jié)果顯示,4、6μM6r分別處理HT29細(xì)胞12、24、36、48h,在36、48h時能顯著抑制細(xì)胞遷移率。Westernblotting結(jié)果顯示,6r可顯著下調(diào)HT29和HCT116細(xì)胞中pro-casepase-3和pro-casepase-9蛋白的表達(dá),上調(diào)Bax/Bcl-2的比例;顯著
8、下調(diào)HCT116、HT29和SW620中PI3K、P-AKT和MDM2蛋白的表達(dá),上調(diào)P53蛋白的表達(dá)。
3VO-OHpic抑制PTEN介導(dǎo)的信號通路,降低6r抗腫瘤作用
MTT及臺盼藍(lán)染色試驗均顯示,在抑制劑VO-OHpic(500nM)存在時,6r(6μM)對HT29和HCT116細(xì)胞生長的抑制作用明顯減弱,與單用6r(6μM)組相比有顯著性差異。Westernblotting結(jié)果顯示,單用6r組HT29和HCT
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