人冠狀動脈內皮細胞與主動脈內皮細胞基因表達譜分析.pdf

1、背景：
　　動脈粥樣硬化(atherosclerosisAS)是動脈硬化中最常見、最重要的一種，因其基本損害從動脈內膜開始局部呈斑塊狀增厚，也被稱為動脈粥樣硬化性斑塊。動脈粥樣硬化發(fā)病率很高，近年來呈增長趨勢。它是一種復雜的多因素疾病，其發(fā)病機制和確切病因尚未完全闡明。動脈內皮細胞層能感知血液中的切應力、壓力、炎性信號、激素水平等信息，通過釋放活性物質對這些信息作出反應，維持血管壁張力、血液流動、屏障、管壁的炎癥修復和血管增生等功

2、能，其作為動脈粥樣硬化開始的起始部，內皮細胞的功能障礙或損傷在動脈粥樣硬化中起到了重要的作用。冠狀動脈近側段好發(fā)動脈粥樣硬化可能與內皮異質性相關，長期環(huán)境因素的影響可能使不同部位的內皮細胞基因表達不同。目前，關于不同種類動脈粥樣硬化與血管內皮基因表達的研究主要偏重于特定的基因，從整體研究基因表達的改變并不多見。基因芯片可以用少量樣品在一次試驗中同時平行分析成千上萬個基因，從整體宏觀的角度研究生物體基因的表達及功能。目前，基因芯片技術已廣

3、泛應用于基因測序、基因表達譜分析、基因突變及多態(tài)性分析、新基因的發(fā)現(xiàn)、藥物篩選、疾病診斷和分型等。本課題主要利用基因芯片技術分析冠狀動脈內皮細胞與主動脈內皮細胞基因表達譜，篩選出表達差異的基因，探討相關的功能和信號通路。
　　目的：
　　芯片技術分析冠狀動脈內皮細胞與主動脈內皮細胞基因表達譜，篩選出表達差異的基因，探討相關的功能和信號通路。
　　方法：
　　提取冠狀動脈內皮細胞（HCAEC）與主動脈內皮細胞(HA

4、EC)株的總RNA，純化后逆轉錄制備雜交探針，采用Agilent公司人基因組寡聚核苷酸芯片篩選差異表達基因，然后采用DAVID功能注釋生物信息學芯片分析系統(tǒng)對P值小于0.05且差異表達大于2倍的基因進行基因富集分析，并用實時定量PCR、免疫印跡(Westernblot)驗證部分篩選基因的表達。選取基因EDN1、OCLN構建過表達質粒，將重組質粒通過脂質體轉染到HCAEC中，用G418篩選出穩(wěn)定株，用Westernblot方法驗證并檢測過

5、表達后對部分基因的影響。然后用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)作出生長曲線圖，用流式細胞術檢測細胞周期，探討EDN1、OCLN對細胞增殖的影響。
　　結果：
　　與主動脈內皮細胞相比，冠狀動脈內皮細胞差異表達在兩倍以上，P值小于0.05的差異點有2435個，其中1198個基因上調，1237個基因下調。GO分類后可見差異表達基因涉及細胞增殖、分化、粘附、炎癥反應、脂代謝、免疫反應、宿主防御、應激反應、離子轉運以及血管生成和細胞凋

6、亡等多個基因及信號通路;Pathways分析后可以得出參與較多基因的信號通路，主要涉及腫瘤途徑、細胞因子間受體相互作用、MAPK信號途徑、粘附分子、細胞骨架調節(jié)、內吞作用、ECM受體相互作用、Jak-STAT信號途徑等。實時定量PCR驗證的部分基因與芯片結果一致。成功構建了EDN1、OCLN過表達質粒并穩(wěn)定轉染到HCAEC中，在蛋白水平，Westernblot結果顯示過表達后的表達量增高。MTT結果顯示過表達后對HCAEC的生長抑制，用

7、流式細胞術檢測細胞周期顯示S期細胞減少，通過細胞周期抑制增殖。
　　結論：
　　應用表達譜基因芯片成功篩選出冠狀動脈內皮細胞與主動脈內皮細胞差異表達基因，經生物學信息分析主要涉及細胞增殖、分化、粘附、炎癥反應、脂代謝、免疫反應、宿主防御、應激反應、離子轉運以及血管生成和細胞凋亡等多個基因及信號通路，可能為研究冠狀動脈粥樣硬化發(fā)病機制及防治提供新思路?；駿DN1、OCLN過表達后對冠狀動脈內皮細胞增殖的影響可能與細胞周期阻滯