抑瘤基因NGX6啟動子的克隆及初步功能研究.pdf

1、NGX6基因是中南大學(xué)腫瘤研究所分子遺傳室采用定位侯選克隆策略克隆的一個侯選抑瘤基因(基因登陸號：AF188239)，定位于染色體9p13.3區(qū)域。開放閱讀框編碼的338個氨基酸，分子量為37kDa，具有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域。胞外區(qū)含有一個EGF-like domain，3個N-糖基化位點。胞內(nèi)區(qū)較短，含有一個酪氨酸激酶磷酸化位點。研究表明，NGX6基因在鼻咽癌和結(jié)直腸癌中表達明顯下降。 前期研究發(fā)現(xiàn)NGX6基因能夠延緩細胞周期的進程

2、；抑制腫瘤增殖和種植瘤的生長；并能抑制腫瘤血管的生成；降低腫瘤細胞體外侵襲能力，同時恢復(fù)腫瘤細胞間隙通訊；并通過抑制核內(nèi)β-catenin的表達負調(diào)控Wnt/β-catenin通路：負調(diào)控SPAK/JNK通路并抑制P-JNK核移位；下調(diào)EGFR-PKC-IRK-NF-κB通路的關(guān)鍵分子和轉(zhuǎn)錄因子；下調(diào)Ezrin下游與侵襲相關(guān)的通路中信號分子的表達。研究證實，NGX6蛋白的EGF樣結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)區(qū)是其調(diào)控細胞黏附的重要功能域，胞內(nèi)區(qū)是其調(diào)節(jié)

3、運動遷移的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。這些功能研究結(jié)果高度提示NGX6在可能腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。 本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，研究了NGX6基因的上游分子事件即轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，希望從調(diào)控該基因表達的上游基因的角度，明確該基因具體的表達調(diào)控機制，以進一步揭示NGX6基因在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的分子機制，深入闡明NGX6基因的生物學(xué)功能。 生物信息學(xué)分析NGX6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域首先應(yīng)用生物信息學(xué)方法對NG

4、X6基因5’側(cè)翼區(qū)序列進行分析。在線軟件PromoterInspector的預(yù)測結(jié)果顯示NGX6基因的調(diào)控區(qū)-157/+91的區(qū)間為其候選啟動子區(qū)，而在線程序FirstEF分析結(jié)果表明-257/+407的區(qū)間為NGX6的候選啟動子區(qū)。運用軟件CpGplot和CpGFinder在線掃描NGX6基因的5'側(cè)翼區(qū)序列，分別發(fā)現(xiàn)其5'上游-107/+299或-21/+310的區(qū)間存在一個CpG島。這兩個軟件的預(yù)測結(jié)果大部分重疊，且與NGX6基因

5、候選啟動子區(qū)域重疊。而TSSW和TRED預(yù)測NGX6基因的可能存在多個轉(zhuǎn)錄起始位點，這種情況在GC富集啟動子區(qū)中是常見的，位于-50/+50區(qū)間。在線軟件MatInspector和TFSEARCH的分析結(jié)果顯示：NGX6基因啟動子區(qū)為一個不含TATA盒，而含有CAAT盒的GC富集區(qū)。它含有多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，其中較重要的結(jié)合位點有：Sp1、Egr-1、RREB、P53、MYC-MAX和AP2等。 NGX6基因啟動子的克隆及鑒定

6、以正常人外周血細胞基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)，獲得了NGX6基因調(diào)控區(qū)長片段-357/+769，并通過熒光素酶活性檢測系統(tǒng)證實該區(qū)域具有與病毒SV40啟動子同等強度的啟動活性。接著以該長片段為模板，依據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果，構(gòu)建了一系列的缺失突變體報告質(zhì)粒，定位了NGX6基因的近距離啟動子為-159/+276區(qū)域。而同時采用綠色熒光蛋白活體檢測法進一步驗證了-159/+276區(qū)域的啟動子活性。 轉(zhuǎn)錄因子Sp1對NGX

7、6基因表達的影響真核基因表達調(diào)控體系中最關(guān)鍵的是轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)控，其基本機制主要包括順式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶三者之間的相互協(xié)同作用，其實質(zhì)是蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。在線軟件MatInspector和TFSEARCH分析NGX6基因的近距離啟動子區(qū)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域中以轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合位點最多，且Threshold值較高。轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點的特異性競爭劑光輝酶素A(Mithramycin A)可大

8、幅度地抑制NGX6啟動子活性，并明顯下調(diào)NGX6基因內(nèi)源性mRNA表達水平。 總之，我們成功獲得了NGX6的啟動子區(qū)域，并確定了其近距離啟動子區(qū)域。NGX6基因啟動子區(qū)域是一個不含TATA盒，而含有CAAT盒的GC富集區(qū)，且該調(diào)控區(qū)內(nèi)存在一個CpG島。初步發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Sp1的抑制劑mithramycin A能夠明顯地抑制NGX6啟動子地活性和NGX6基因的表達。對NGX6基因調(diào)控區(qū)的CpG島甲基化的探討以及其他的順式作用元件和反