山核桃COP1等成花相關(guān)基因的克隆及其表達特性分析.pdf

1、成花是植物生活史上一個質(zhì)變的過程,即從營養(yǎng)生長向生殖生長、孢子體向配子體轉(zhuǎn)變的重要轉(zhuǎn)折點,是植物發(fā)育過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),整個過程有著復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。近幾十年來,利用分子生物學(xué)等技術(shù)研究花的發(fā)育,尤其是成花基因的克隆,極大地促進了成花機理的研究。山核桃(Carya cathayensis Sarg.)隸屬胡桃科山核桃屬(Carya Nutt.),是浙江省的特色經(jīng)濟干果。山核桃雌雄同株,雄花為下垂的葇荑花序,雌花為短穗狀花序,它們的形成存

2、在著時空上的差異。山核桃成花對山核桃的產(chǎn)量至關(guān)重要。因此,研究山核桃的成花,闡明其調(diào)控機制,對提高山核桃產(chǎn)量是十分必要的。之前我們已經(jīng)掌握了山核桃雌雄花芽的分化發(fā)育的各個時期,但是成花的分子機理仍然需要進一步的深入研究。本課題組利用454測序技術(shù)對山核桃成花過程進行了深度測序,其中測得CcCOP1 E3連接酶,絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶,泛素活化酶E1,泛素蛋白連接酶RIN2-like和SPINDLY-like基因的片段,利用RACE技術(shù)

3、克隆獲得了這5個基因的全長;利用生物信息學(xué)手段分析了它的蛋白特性和不同物種的同源基因之間的親緣關(guān)系;利用Real-Time PCR技術(shù)進一步分析了在這五個基因雌雄花發(fā)育過程中的表達變化。這為以后更好地掌握其他基因的調(diào)控機理打下了堅實的基礎(chǔ)。主要研究結(jié)論如下:
　　(1)從山核桃花芽中得到CcCOP1 E3連接酶基因大小為2331bp,編碼707個氨基酸,由2個特殊的結(jié)構(gòu)域組成即環(huán)形鋅指結(jié)合域和WD-40重復(fù)序列,其編碼的蛋白親水性

4、較強,親水性氨基酸主要集中在氨基端,疏水性氨基酸主要集中于羧基端;絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶基因大小為1895bp,編碼626個氨基酸,它由2個特殊的結(jié)構(gòu)域TPR結(jié)合域和MPP組成;泛素活化酶E1基因大小為3346bp,編碼1112個氨基酸,由2個重復(fù)的結(jié)構(gòu)域組成即E1-enzyme超級家族組成;泛素蛋白連接酶RIN2-like基因大小為1761bp,編碼587個氨基酸,由特殊的結(jié)構(gòu)域 RING型結(jié)構(gòu)域組成;SPINDLY-like基因大

5、小為2274bp,編碼754個氨基酸,由4個重復(fù)的TPR超級家族結(jié)構(gòu)域組成。
　　(2)將這五個基因分別與已知的其他物種的同源序列進行 Blast比對后構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。分析表明:CcCOP1 E3連接酶與蓖麻等的親緣關(guān)系最近,與烏拉爾圖小麥和二穗短柄草等的親緣關(guān)系相對較遠;絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶與葡萄等的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶親緣關(guān)系最近,與玉米等的親緣關(guān)系相對較遠;泛素活化酶E1與與甜橙等的泛素活化酶E1親緣關(guān)系最近,與短花

6、藥野生稻等的親緣關(guān)系相對較遠;泛素蛋白連接酶RIN2-like與野草莓等的泛素蛋白連接酶RIN2-like親緣關(guān)系最近,與灰倉鼠等的親緣關(guān)系相對較遠;SPINDLY-like基因與羅莎等的SPINDLY-like基因親緣關(guān)系最近,與黃瓜等的親緣關(guān)系相對較遠,表明這該基因的進化過程存在種屬差異性。
　　(3)實時定量PCR分析表明,CcCOP1 E3連接酶,絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶,泛素活化酶 E1,泛素蛋白連接酶RIN2-like