山核桃RCA基因克隆、表達及其在抗高溫中的作用.pdf

1、山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是重要的木本油料作物，生產(chǎn)中易受到自然逆境脅迫因素影響，尤其是高溫，高溫下嚴(yán)重限制植物光合作用致使山核桃生長，結(jié)實，有機物積累等都受到影響。因此，對山核桃光合作用相關(guān)基因的開發(fā)和利用具有重要的意義。在高等植物中光合作用關(guān)鍵步驟固定CO2過程需要Rubisco酶的催化，Rubisco酶的活性由植物體內(nèi)復(fù)雜的機制進行調(diào)控，其中大量研究已證實Rubisco activase（RCA）能夠

2、活化并維持Rubisco酶的催化活性。同時RCA也被認(rèn)為是植物在各種不同環(huán)境脅迫下對光合作用的關(guān)鍵調(diào)控因素。因此，Rubisco活化酶的功能研究對于增強植物體內(nèi)Rubisco酶活性穩(wěn)定光合作用系統(tǒng)，進而提高植物適應(yīng)逆境的能力具有重要作用。
　　本試驗通過應(yīng)用RACE技術(shù)，克隆得到了山核桃2個RCA基因的全長cDNA序列，命名為CcRCAα和CcRCAβ。序列開放閱讀框長度分別為1419bp、1302bp，推測編碼472和433個氨

3、基酸。利用DNAMAN軟件對山核桃RCA基因與葡萄等物種的RCA氨基酸序列進行的多重序列比對，結(jié)果表明，兩者氨基酸序列相似性很高，且與葡萄等物種的RCA序列同源性高達87％以上。本試驗還得到了山核桃另一個RCA基因cDNA序列，命名為CcRCAβ2，分析表明，其氨基酸序列與CcRCAβ的相似性高達96%以上，同屬于β類型RCA基因。
　　此外，本文以pET28a+載體為表達載體，構(gòu)建了載有山核桃CcRCAα的原核表達載體，通過IP

4、TG法誘導(dǎo)BL21(DE3)表達菌株表達具有可溶性的RCA異源蛋白，并經(jīng)條件優(yōu)化得到原核表達的最適條件：培養(yǎng)基體積20ml中加入終濃度1mM的IPTG經(jīng)28℃誘導(dǎo)4-6小時。為進一步研究山核桃RCA基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　本文還對山核桃RCA基因在高溫脅迫下的表達模式進行了研究，結(jié)果表明，高溫下山核桃光合速率、Rubisco酶活力及RCA基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平呈下降趨勢，高溫抑制山核桃光合作用，可能通過影響RCA基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯進