山核桃嫁接成活相關(guān)基因克隆.pdf

1、嫁接是一門園藝技術(shù),其成活過程包含細胞脫分化、再分化等重大理論問題。山核桃嫁接是公認(rèn)的難題,為了深入探索這一珍貴物種的嫁接分子機理和調(diào)控機制,本研究采用cDNA-AFLP技術(shù)和定量RT-PCR技術(shù)對山核桃嫁接成活相關(guān)基因進行篩選、分離和生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明:
　　 1.利用改良的CTAB法提取的嫁接樣品總RNA質(zhì)量高、完整性好、無雜質(zhì),適用于cDNA-AFLP分析和熒光定量RT-PCR分析。
　　 2.利用SMART

2、TM PCR cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄獲得的8個實驗材料雙鏈cDNA,完整性好,滿足實驗要求。
　　 3.用識別4堿基和6堿基的限制性內(nèi)切酶TaqⅠ、AseⅠ消化cDNA,所得片段長度符合技術(shù)要求。酶切片段與人工接頭連接后進行預(yù)擴,獲得相當(dāng)濃度的200～1000bp的酶切片段拷貝。
　　 4.選用100對選擴引物進行了選擇性擴增。改進選擴程序,采用高溫(65℃)退火結(jié)合循環(huán)降溫方法,獲得高濃度的特異性產(chǎn)

3、物。
　　 5.用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染對選擴產(chǎn)物進行差異顯示,結(jié)果共獲得300多條差異表達片段。經(jīng)切膠回收、純化和二次克隆等所得差異片段100多條。共測回來的序列66條,經(jīng)Blast比序,除去重復(fù)序列17條,結(jié)果獲得了49條TDFs。
　　 6.選取其中12條基因進行定量RT-PCR驗證分析,結(jié)果顯示,其中八個克隆translational initiation factor eIF-4A,3'-5'-exor

4、ibonuclease/RNA binding(AT2G47220),18號未知基因,isolate K1/E32 K1 glycoprotein,putative auxin response factor1,waterchannel(PIP1B),Glycine max catalase(cat4),65號未知基因與cDNA-AFLP的表達一致,一個克隆25號未知基因與cDNA-AFLP的表達基本一致,而其余三個克隆17號未知基因,

5、beta family G-protein,cdc20 protein(CDC20.2)的表達與cDNA-AFLP的表達結(jié)果有差異。本實驗cDNA-AFLP的表達譜中的75％得到驗證。
　　 7.在49條TDFs中,有20個編碼已知功能蛋白,8個編碼未知功能蛋白,其余的21個與未注釋的基因組序列相似,或者在核苷酸數(shù)據(jù)庫無同源序列。對20個已知功能的基因進行功能分析,它們分屬于物質(zhì)運輸,代謝和能量,細胞周期,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等9類,說明山