人端粒酶逆轉錄酶基因的轉染對牛耳成纖維細胞壽命及核移植的影響.pdf

1、由于成纖維細胞具有有限的分裂次數，在50PDs左右進入衰老階段，80PDs左右進入危機階段，細胞凋亡。所以成纖維細胞這種“短暫”的壽命，是無法滿足轉基因核移植的要求的，限制了在科研和實際當中的應用。作為轉基因核移植的供體細胞，至少要能存活到45PDs以上，這樣才能保證外源基因在細胞內的整合和正常表達，以及其它為核移植的所作的前期準備工作的順利完成。本試驗將攜帶有增強型綠色熒光蛋白(enhanced green nuorescent pr

2、otein，EGFP)報告基因和人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcfiptase，hTERT)目的基因的質粒PEGFPC1-hTERT通過脂質體轉染法轉入牛耳成纖維細胞，并考察其壽命以及對核移植的影響，為生產轉基因動物做準備。 1、用含10％血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)牛耳成纖維細胞，通過脂質體Lipofactamine 2000將外源端粒酶逆轉錄酶基因hTERT轉入牛耳成纖維細胞，用熒光

3、顯微鏡觀測EGFP的表達，用600 ug/mL G418篩選獲得陽性克隆，然后換為含300 ug/mL G418的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)使陽性克隆得到擴增。 2、獲得的陽性克隆提取RNA，設計特異性引物進行RT-PCR反應，經電泳分析在443bp處出現(xiàn)目的條帶，未轉染的細胞無目的條帶。轉染后的12代(TN12)和22代(TN22)細胞端粒酶活性檢測均呈陽性，未轉染的細胞無端粒酶活性。 3、測定陽性細胞12代(TN12)和22代(

4、TN22)以及陰性細胞12代(N12)和22代(N22)的生長曲線與群體倍增次數進行比較。群體倍增指數分別為4.14±0.13，3.27±0.09，3.14±0.06，2.06±0.05，TN22與N12差異不顯著(p>0.05)，TN12和N22與各組均差異顯著(p<0.05)。結果顯示陽性細胞生長速度明顯高于未轉染的陰性細胞，壽命延長，但只越過了衰老期(50PDs左右)，沒有越過危機期(80PDs左右)，不能永生化。經流式細胞儀檢測