hTERT(人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因)轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞后對(duì)其影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:1.采用7天左右的新生SD大鼠的雪旺細(xì)胞用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行hTERT的轉(zhuǎn)染，體外分離培養(yǎng)，探索安全、高效的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法期望獲得永生化的雪旺細(xì)胞。
　　 2.對(duì)轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的雪旺細(xì)胞在細(xì)胞的增殖周期、形態(tài)、分泌功能方面的變化進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，通過具體的實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞永生化以后的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)，對(duì)永生化的雪旺細(xì)胞應(yīng)用于神經(jīng)組織工程奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:1.選取出生后7天左右的SD大鼠，冰凍處死后碘伏浸泡消毒，

2、取其坐骨神經(jīng)以及臂叢神經(jīng)，剪碎至1mm3大小的組織塊，雙酶消化法進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到85％匯合密度時(shí)用低濃度胰酶快速消化傳代，30分鐘差速貼壁法進(jìn)一步純化雪旺細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照，S-100蛋白免疫熒光鑒定拍照。
　　 2.將純化的雪旺細(xì)胞用含hTERT基因的質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)滿80％密度時(shí)更換含G418(100ug/ml)的完全培

3、養(yǎng)基，每3天換液1次，篩選2周，轉(zhuǎn)入含hTERT基因的質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)過篩選獲得陽性克隆后繼續(xù)傳代培養(yǎng)，傳代后的細(xì)胞一部分用于S-100蛋白免疫熒光鑒定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組的細(xì)胞周期，免疫印跡Westernblot法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞的的5、10、15、20代以及對(duì)照組未轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NGF)的分泌。
　　 結(jié)果:1.經(jīng)雙酶消化法可以獲得大量增殖的雪旺細(xì)胞，差速貼壁傳代后可以獲得典型的長(zhǎng)梭

4、形放射狀肩并肩排列的雪旺細(xì)胞，光鏡視野下雪旺細(xì)胞純度可以達(dá)到90％以上，成纖維細(xì)胞量少，經(jīng)S-100蛋白免疫熒光測(cè)定鑒定為雪旺細(xì)胞
　　 2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染hTERT后光學(xué)顯微鏡觀察可見轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞胞體體積大，長(zhǎng)梭形。無規(guī)則貼壁生長(zhǎng)，胞質(zhì)黃色，經(jīng)S-100免疫熒光鑒定為雪旺細(xì)胞
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞為42.76％，未轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞S期為13.99％。
　　 4.經(jīng)weste