表皮干細(xì)胞及去分化細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)分布的初步研究.pdf

1、目的：從建立表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells，ESCs)及去分化細(xì)胞的模型人手，比較去分化細(xì)胞和表皮干細(xì)胞功能和生物學(xué)特性，為去分化細(xì)胞應(yīng)用于皮膚組織創(chuàng)傷修復(fù)的研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.ESCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定人包皮皮片去除皮下脂肪組織，中性蛋白水解酶消化分離表皮和真皮。得到的表皮片剪碎經(jīng)胰蛋白酶消化，200目篩網(wǎng)研磨濾過(guò)。離心收集細(xì)胞，接種于鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)37℃孵育20min。換液去

2、除懸浮的細(xì)胞和雜質(zhì)，黏附在Ⅳ型膠原被膜上的細(xì)胞則為表皮基底層干細(xì)胞，胰酶消化傳代。鏡下觀察細(xì)胞集落生長(zhǎng)情況，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 2.人表皮去分化細(xì)胞的誘導(dǎo)、擴(kuò)增及鑒定(1)表皮去分化細(xì)胞在體環(huán)境制備及鑒定人包皮的表皮片用Ⅳ型膠原反復(fù)粘連、沖洗去除表皮干細(xì)胞，處理后的表皮片移植到全層皮膚切割傷BALB/c裸鼠，7d后用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植的存活皮片的表型改變。(2)表皮去分化細(xì)胞離體條件下的誘導(dǎo)、培

3、養(yǎng)及鑒定體外培養(yǎng)表皮角質(zhì)細(xì)胞(human epidermal keratinocytes，HEKs)，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，加入不同濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)誘導(dǎo)培養(yǎng)，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 3.利用TRAP、激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)ESCs和去分化細(xì)胞端粒酶活性及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse t

4、ranscriptase，hTERT)定位表達(dá)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞周期及染色體核型進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1.ESCs呈集落性生長(zhǎng)，陽(yáng)性表達(dá)β1整合素、CK19和CK14，而CK10陰性表達(dá)。 2.用Ⅳ型膠原粘連后的包皮皮片CK19和β1整合素染色陰性；移植7d后存活皮片CK19和β1整合素陽(yáng)性染色呈多層分布，而不是正常表皮中的單層分布。體外培養(yǎng)HEKs加入100ng/ml bFGF組，2w后可見(jiàn)細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良

5、好，CK19和CK14呈陽(yáng)性表達(dá)。 3.ESCs和去分化細(xì)胞都具有端粒酶活性，并與細(xì)胞周期密切相關(guān)；兩者h(yuǎn)TERT核仁定位與腫瘤細(xì)胞存在差異；ESCs和去分化細(xì)胞均為正常核型。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)的分離培養(yǎng)體系能夠成功的獲得保持未分化狀態(tài)的ESCs。 2.進(jìn)一步確證去分化這一生物學(xué)現(xiàn)象存在的可靠性；表皮細(xì)胞的去分化與bFGF的誘導(dǎo)作用有關(guān)。 3.ESCs、表皮去分化細(xì)胞hTERT核定位與腫瘤細(xì)胞存