慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾肺癌端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　在我國(guó)，所有惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率中，肺癌均位于首位。盡管目前肺癌的治療方法打破了傳統(tǒng)的單一治療模式，形成了多學(xué)科綜合治療方案，但肺癌總的5年生存率僅為5％-10%，因此學(xué)者們?cè)谂μ剿餍碌寞煼ǎΩ纳七@一現(xiàn)狀。
　　近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)端粒酶與肺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。端粒酶是由RNA組分和蛋白組分組成的核糖核蛋白復(fù)合體，其中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcr

2、iptase，hTERT）是端粒酶的主要成分，是端粒酶發(fā)揮活性和細(xì)胞癌變的限速因素，因而有望成為肺癌治療的全新靶點(diǎn)。
　　利用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，由小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）在轉(zhuǎn)錄后水平特異性降解靶基因，進(jìn)而抑制異常蛋白的表達(dá)，最終達(dá)到調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。
　　本研究針以hTERT mRNA基因?yàn)榘悬c(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的siRNA表達(dá)載

3、體，轉(zhuǎn)染到肺癌A549細(xì)胞，利用Real Time RT-PCR技術(shù)、western blot技術(shù)、MTT技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)，探討慢病毒介導(dǎo)的siRNA針對(duì)肺癌細(xì)胞中hTERT mRNA、hTERT表達(dá)水平的下調(diào)以及對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響。
　　研究?jī)?nèi)容和方法：
　　1.重組siRNA表達(dá)載體，結(jié)合慢病毒載體pGCSIL-GFP的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)并合成四條互補(bǔ)的DNA oligo，把DNA oligo克隆進(jìn)慢病毒載體——p

4、GCSIL-GFP的U6啟動(dòng)子下游，通過(guò)基因測(cè)序法鑒定所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體。
　　2.用Real Time RT-PCR技術(shù)、western blot技術(shù)檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后hTERT mRNA、hTERT表達(dá)水平的變化情況。
　　3.用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1.基因測(cè)序證實(shí)插入序列符合設(shè)計(jì)要求。成功構(gòu)建了siRNA表達(dá)載體。
　　2.與

5、NC-siRNA組相比，hTERT-siRNA組hTERT mRNA、hTERT表達(dá)量顯著下降，72h最高，抑制率分別為的（75.06±5.04）%、（55.74±3.30）%。
　　3.與NC-siRNA組相比，hTERT-siRNA組細(xì)胞增殖能力降低，抑制率為49.67±5.88%，
　　4.與NC-siRNA組相比，hTERT-siRNA組細(xì)胞凋亡增加，凋亡率為31.51±1.59%
　　結(jié)論：
　　1.成