重組人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因表達載體的構(gòu)建及檢測端粒長度新方法初探.pdf

1、第一章人端粒酶催化亞基(hTERT)的研究現(xiàn)狀和研究進展（文獻綜述）
　　人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因是端粒酶的催化亞基，負責(zé)在染色體末端添加端粒重復(fù)序列，在維持細胞永生化中起重要作用。為探索過表達外源性hTERT基因轉(zhuǎn)染對細胞生物學(xué)作用，本研究以人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(hUVEC)為研究對象，通過真核轉(zhuǎn)染及病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)促進hTERT基

2、因在hUVEC細胞中過表達，觀察其對hUVEC細胞增殖作用和端粒酶活性的影響?，F(xiàn)綜合近年來的文獻，對人端粒酶催化亞基的研究現(xiàn)狀作一簡要綜述。
　　第二章過表達人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶促進人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖
　　目的:構(gòu)建含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的真核表達載體并轉(zhuǎn)染人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(hUVEC)，探索轉(zhuǎn)染后hTERT基因的表達及對細胞功能和生長的影響。
　　方法:攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的重組

3、質(zhì)粒（pEGFP-C1-hTERT）是利用已有的PCI-neo-hTERT和pEGFP-C1質(zhì)粒，通過酶切連接后，DNA測序驗證了重組質(zhì)粒pEGFP-C1-hTERT的準確性。將pEGFP-C1-hTERT真核表達載體通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到hUVEC中，通過RT-PCR、免疫組化、PCR-ELISA法和MTT檢測細胞端粒酶基因表達和活性變化與細胞生長增殖情況。
　　結(jié)果:所構(gòu)建pEGFP-C1-hTERT真核表達載體結(jié)構(gòu)正確并能

4、夠在真核細胞中表達。轉(zhuǎn)染后細胞可見報告基因GFP的表達;MTT實驗可見轉(zhuǎn)染hTERT基因組72 h后細胞增殖速度快于未轉(zhuǎn)染組及空載體組;RT-PCR、免疫組化及TRAP-PCR-ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后的細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hTERT mRNA的表達、端粒酶活性均明顯增強。
　　結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了pEGFP-C1-hTERT真核表達載體并能夠在真核細胞中表達，過表達的hTERT基因提高了血管內(nèi)皮細胞端粒酶的活性和增殖能力，初步證實端粒

5、酶活性與細胞增殖活性密切相關(guān)，為進一步構(gòu)建永生化細胞系奠定基礎(chǔ)。
　　第三章構(gòu)建攜帶重組人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶第三代慢病毒載體及其病毒包裝鑒定
　　目的:構(gòu)建攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的慢病毒表達載體及探索高滴度第三代慢病毒包裝體系的建立，并觀察hTERT基因調(diào)控表達。
　　方法:用內(nèi)切酶將hTERT基因從已有質(zhì)粒PCI-neo-hTERT上切下，插入慢病毒載體pCDH-copGFP中構(gòu)建慢病毒表達質(zhì)粒pCDH-

6、hTERT，通過雙酶切鑒定、DNA測序分析驗證人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)片段的準確性后，將pCDH-hTERT、pCDH-PACK-GAG、pCDH-PACK-REV和VSV-G共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T，濃縮上清并測定病毒滴度獲得重組慢病毒，并進行PCR及293T中hTERT蛋白的表達鑒定重組慢病毒的包裝。重組慢病毒再感染靶細胞hUVEC，通過檢測標記蛋白-綠色熒光蛋白、hTERT蛋白表達和端粒酶活性進一步驗證pCDH-hTERT

7、在細胞中表達。
　　結(jié)果:pCDH-hTERT攜帶正確hTERT基因，將其與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞能產(chǎn)生重組病毒;病毒基因組PCR證實hTERT基因插入，感染后293T可檢測到hTERT蛋白的表達;目的基因hTERT能被重組慢病毒高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細胞并穩(wěn)定表達，熒光顯微鏡下可直接觀察GFP; RT-PCR法、Western blotting法及TRAP-PCR-ELISA法能檢測感染后的細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hTERT mRNA的表達、

8、hTERT蛋白的表達及端粒酶活性明顯增強。
　　結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了第三代慢病毒表達載體pCDH-hTERT，并獲得高效的重組慢病毒，將外源hTERT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細胞重建端粒酶活性，為構(gòu)建永生化細胞系奠定基礎(chǔ)。
　　第四章廣西長壽物種端粒長度的檢測與納米金標記的巰基寡聚核苷酸探針快速靈敏檢測端粒長度新方法的初探
　　目的:應(yīng)用Southern雜交技術(shù)對不同年齡段不同長壽物種端粒長度進行檢測，從而了解Southern雜

9、交對端粒長度檢測的利弊，評估其是否適用于其他長壽物種的檢測，探討建立檢測針對不同物種端粒長度新方法的必要性，并初步探索利用納米金技術(shù)建立快速靈敏檢測端粒長度新方法可行性。
　　方法:選擇廣西常見的長壽物種草龜、眼鏡蛇作為研究對象，應(yīng)用Southern雜交技術(shù)進行檢測不同年齡段不同長壽物種端粒長度，對檢測端粒長度進行比較研究。以已知三種不同長度的端粒重復(fù)片段為標準品，初步探索將納米金的共振散射效應(yīng)和納米金標記核酸探針結(jié)合起來建立一種

10、測定端粒長度的新方法。通過制備粒徑約10納米的金納米顆粒，用于標記針對人端粒重復(fù)序列的共振散射光譜探針5'-(CCCTAA)5(CH2)3SH-3'，對標記納米金生物探針上寡核苷酸連接及與樣品端粒雜交反應(yīng)體系條件進行優(yōu)化，探索利用納米金技術(shù)建立快速靈敏檢測端粒長度新方法的可行性。
　　結(jié)果:所應(yīng)用Southern雜交技術(shù)進行檢測不同年齡段不同長壽物種端粒長度特異性及靈敏性均不高，各組間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。并成功完成標記納米金生物探

11、針上寡核苷酸的連接，通過優(yōu)化了雜交反應(yīng)體系中緩沖溶液的pH、AussDNA濃度、NaCl濃度、超聲波輻照時間等四個主要反應(yīng)條件的影響，雜交后信號波動較大，但仍未找到適合的雜交的反應(yīng)條件，尚未能建立起穩(wěn)定的納米金探針檢測端粒長度的新方法。
　　結(jié)論:Southern雜交技術(shù)采用針對人端粒重復(fù)片段特定探針，不適合應(yīng)用丁其他長壽物種的檢測，故需建立快速靈敏檢測針對不同物種端粒長度新方法。新方法中標記好納米金生物探針與樣品端粒雜交反應(yīng)體系