mTOR在TGF-β2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞間葉樣轉(zhuǎn)化過程中的作用.pdf

1、晶狀體上皮細(xì)胞(Lensepithelialcells，LECs)對(duì)晶狀體的生長(zhǎng)發(fā)育、維持晶狀體的正常生理功能至關(guān)重要。LECs生長(zhǎng)、增殖、移行、分化和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的等方面的異常是多種晶狀體疾病特別是后囊膜混濁(posteriorcapsularopacification，PCO)的基礎(chǔ)[1]。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforminggrowthfactorβ，TGF-β）是上皮細(xì)胞向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial

2、tomesenchymaltransition，EMT)的關(guān)鍵因子[2]，現(xiàn)有研究表明，在TGF-β的幾種亞型中，TGF-β2在房水中含量最高，且能有效誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞(HumanlensepithelialcellsHLECs)發(fā)生EMT[3]，目前已成為研究PCO時(shí)細(xì)胞模型的常用建造工具。
　　 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，

3、在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過程中發(fā)揮中心樞紐的作用[5]。此外，mTOR能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附與移行，參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化[6]，但是，mTOR是否在LECs中存在表達(dá)，以及mTOR在HLECs向間葉樣轉(zhuǎn)分化過程中的活化水平及其是否參與調(diào)節(jié)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化至今尚未見報(bào)道。
　　 目的：
　　 明確mTOR在TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的活化情況(磷酸化水平S2448-P，S2481

4、-P)及作用。
　　 方法：
　　 1、建立TGF-β2誘導(dǎo)HLECs的EMT體外培養(yǎng)體系
　　 培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞換用無血清DMEM培養(yǎng)基后，加入TGF-β2，使其終濃度為10ng/ml，分別培養(yǎng)0h、1h、6h、12h、24h、48h，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，westernblot法檢測(cè)HLECs上皮細(xì)胞標(biāo)志物縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)、上皮性鈣黏附蛋白(E-cad

5、herin，E-cad)和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)的表達(dá)水平。
　　 2、westernblot法檢測(cè)mTOR及其磷酸化水平（S2448-P，S2481-P）在TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs的EMT過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。
　　 3、觀察mTOR在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs的EMT過程中的活化水平及其作用
　　

6、 3.1、確定mTOR抑制劑雷帕霉素和KU-0063794的最佳作用濃度。
　　 將濃度梯度為0nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM的mTOR抑制劑雷帕霉素和KU-0063794分別加入HLECs-B3細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，westernblot法檢測(cè)mTOR及其磷酸化水平(S2448-P，S2481-P)。根據(jù)二者對(duì)mTOR磷酸化水平的抑制情況以及細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，選

7、擇下一步實(shí)驗(yàn)中雷帕霉素和KU-0063794的作用濃度。
　　 3.2、觀察mTOR在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs的EMT過程中的活化水平以及mTOR抑制劑對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)HLECs向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。
　　 3.2.1、將實(shí)驗(yàn)分為以下組:
　　 對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系，生長(zhǎng)至80％融合后，換用無血清DMEM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24h。
　　 TGF-β2組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)

8、胞系，生長(zhǎng)至80％融合后，換用無血清DMEM培養(yǎng)基后，終濃度為10ng/mlTGF-β2處理24h。
　　 雷帕霉素組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系，生長(zhǎng)至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的雷帕霉素（最佳濃度由上述實(shí)驗(yàn)3得到）處理24h。
　　 KU-0063794組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系，生長(zhǎng)至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的KU-0063794(最佳濃度由上述實(shí)驗(yàn)3得到)

9、處理24h。
　　 雷帕霉素+TGF-β2組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系，生長(zhǎng)至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的雷帕霉素預(yù)處理1h后，10ng/mlTGF-β2處理24h。
　　 KU-0063794+TGF-β2組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系，生長(zhǎng)至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的KU-0063794預(yù)處理1h后，10ng/mlTGF-β2處理24h。
　　 TGF-

10、β2+雷帕霉素組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系，生長(zhǎng)至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，終濃度為10ng/mlTGF-β2處理24h誘導(dǎo)HLECs，待HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化后，再加入最佳濃度的雷帕霉素處理24h。
　　 TGF-β2+KU-0063794組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系，生長(zhǎng)至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，10ng/mlTGF-β2處理24h誘導(dǎo)HLECs，待HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化后，再加入最佳濃

11、度的KU-0063794處理24h。
　　 3.2.2、westernblot法檢測(cè)mTOR的表達(dá)及其磷酸化水平(S2448-P，S2481-P)。
　　 3.2.3、westernblot法檢測(cè)各組上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cad、Cx43，和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志FN、α-SMA的表達(dá)水平。
　　 4、所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(-x)±s表示，利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本摘要“方法”部分“1”，“2”，“3.1”項(xiàng)中所

12、述的westernblot實(shí)驗(yàn)均采用One-wayANOVA分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的兩兩比較采用Dunnettt法。本摘要“方法”部分“3.2.2”和“3.2.3””項(xiàng)中所述的westernblot實(shí)驗(yàn)采用One-wayANOVA分析，LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、在10ng/mlTGF-β2誘導(dǎo)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化過程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，HLECs從類橢圓形、多角

13、形逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，且細(xì)胞間隙增大。與未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs相比，E-cad和Cx43分別于培養(yǎng)的第6h和12h時(shí)表達(dá)開始下降(E-cad:1.059±0.004,P=0.000;Cx43:0.477±0.076,P=0.032),FN和α-SMA于24h時(shí)表達(dá)開始增高(FN:0.872±0.134，P=0.011;α-SMA:0.516±0.049，P=0.000)。
　　 2、在10ng/mlTGF-β2誘導(dǎo)HLEC

14、s間葉樣轉(zhuǎn)化過程中，mTOR在2448和2481位點(diǎn)的磷酸化水平從培養(yǎng)的6h開始增高(S2448-P:0.542±0.124，P=0.006，S2481-P:0.519±0.122，P=0.006)，并呈時(shí)間依賴性的磷酸化程度上調(diào)，在24h時(shí)達(dá)到最高水平，但mTOR總表達(dá)量沒有變化。
　　 3、mTOR抑制劑可阻斷TGF-β2誘導(dǎo)HLECs的向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化
　　 3.1、倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，使用雷帕霉素或KU-006

15、3794處理HLECs，隨著雷帕霉素和KU-0063794的濃度增高，貼壁HLECs數(shù)量減少，漂浮細(xì)胞增多，濃度為300nM的KU-0063794處理HLECs24h后，細(xì)胞密度稀疏，濃度為1000nM的KU-0063794處理HLECs24h后，細(xì)胞接近全部漂浮死亡。Westernblot顯示10nM的雷帕霉素和KU-0063794均能抑制mTOR(S2448-P，S2481-P)的磷酸化水平，且成一定的濃度依賴性，但各濃度的雷帕霉素

16、和KU-0063794均不影響mTOR的總表達(dá)量。結(jié)合形態(tài)學(xué)，當(dāng)KU-0063794濃度高于100nM時(shí)，貼壁HLECs稀疏，難以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)處理，故選擇100nM雷帕霉素和KU-0063794進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 3.2、mTOR抑制劑可阻斷TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs向間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化
　　 3.2.1、mTOR抑制劑雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs內(nèi)mTOR磷酸化激活

17、　　 與對(duì)照組相比，“TGF-β2組”的HLECs內(nèi)mTOR被磷酸化激活(S2448-P為0.884±0.015，P=0.000;S2481-P為0.874±0.115，P=0.000)，而“雷帕霉素+TGF-β2組”和“KU-0063794+TGF-β2組”中，TGF-β2引起的HLECs內(nèi)mTOR磷酸化激活被抑制，（“雷帕霉素+TGF-β2組”與“TGF-β2組”相比mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000;“KU-

18、0063794+TGF-β2組”與“TGF-β2組”相比mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000）。與“TGF-β2組”相比，“TGF-β2+雷帕霉素組”和“TGF-β2+KU-0063794組”中已完成EMT的HLECs中mTOR磷酸化仍被抑制（“TGF-β2+雷帕霉素組”與“TGF-β2組”相比，mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000;“TGF-β2+KU-0063794組”與“TGF-β2組”相比mT

19、ORS2448-P及S2481-P:P=0.000）。但是，“TGF-β2+雷帕霉素組”的mTOR磷酸化水平高于“雷帕霉素+TGF-β2組”，“TGF-β2+KU-0063794組”的mTOR磷酸化水平高于“KU-0063794+TGF-β2組”(TGF-β2+雷帕霉素組與雷帕霉素+TGF-β2組相比，mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000;TGF-β2+KU-0063794組與KU-0063794+TGF-β2組相比，

20、mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000）。KU-0063794對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)HLECs中mTOR磷酸化的抑制效果強(qiáng)于雷帕霉素(“KU-0063794+TGF-β2組”與“雷帕霉素+TGF-β2組”相比以及“TGF-β2+KU-0063794組”與“雷帕霉素+TGF-β2組”相比mTORS2448-P、S2481-P:P=0.000）。
　　 3.2.2、雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制TGF-β2誘

21、導(dǎo)的HLECs內(nèi)上皮細(xì)胞標(biāo)志物Cx43、E-cad的表達(dá)下降以及間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物FN、α-SMA的表達(dá)升高。
　　 “對(duì)照組”HLECs中表達(dá)豐富的E-cad、Cx43以及微量的FN和α-SMA、“雷帕霉素組”或“KU-0063794組”中上皮/間葉樣標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平與“對(duì)照組”無差別（“雷帕霉素組”與“對(duì)照組”相比，E-cadP=0.863，Cx43P=0.807，F(xiàn)NP=0.859、α-SMAP=0.782;“KU-006

22、3794組”與“對(duì)照組”相比，E-cadP=0.773，Cx43P=0.834，F(xiàn)NP=0.395、α-SMAP=0.245)?！癟GF-β2組”中E-cad、Cx43表達(dá)較“對(duì)照組”下降，而FN、α-SMA的表達(dá)升高(“TGF-β2組”與“對(duì)照組”相比，4種標(biāo)志蛋白P=0.000)?！袄着撩顾?TGF-β2組”與“TGF-β2組”相比，E-cad、Cx43表達(dá)增多，F(xiàn)N、α-SMA表達(dá)減少(4種標(biāo)志蛋白均為P=0.000);“KU-0

23、063794+TGF-β2組”與“TGF-β2組”相比，E-cad、Cx43表達(dá)增多，F(xiàn)N以及α-SMA表達(dá)減少（4種標(biāo)志蛋白均為P=0.000）。與“TGF-β2組”相比，“TGF-β2+雷帕霉素組”和“TGF-β2+KU-0063794組”中E-cad、Cx43表達(dá)量升高、FN以及α-SMA表達(dá)下降（與“TGF-β2組”相比，“TGF-β2+雷帕霉素組”和“TGF-β2+KU-0063794組”中4種標(biāo)志蛋白均為P=0.000）。“

24、TGF-β2+雷帕霉素組”中E-cad、Cx43的表達(dá)量少于“對(duì)照組”，F(xiàn)N以及α-SMA表達(dá)量高于“對(duì)照組”(4種標(biāo)志蛋白均為均為P=0.000)?！癟GF-β2+KU-0063794組”中FN表達(dá)量與“對(duì)照組”相當(dāng)(FNP=0.071)，但E-cad及Cx43表達(dá)量低于“對(duì)照組”，α-SMA表達(dá)量高于“對(duì)照組”(E-cadP=0.017、Cx43P=0.001以及α-SMAP=0.000)?！癟GF-β2+雷帕霉素組”與“雷帕霉素+

25、TGF-β2組”相比，E-cad與Cx43的表達(dá)量少，而FN及α-SMA的表達(dá)量多(4種標(biāo)志蛋白均為P=0.000)?！癟GF-β2+KU-0063794組”與“KU-0063794+TGF-β2組”相比，E-cad表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.063)，但Cx43的表達(dá)量減少(P=0.003)，F(xiàn)N和α-SMA的表達(dá)量增多(P=0.000)。“KU-0063794+TGF-β2組”與“雷帕霉素+TGF-β2組”相比，E-cad及Cx43

26、的表達(dá)量增多，而FN與α-SMA的表達(dá)量減少(E-cadP=0.006，Cx43P=0.012，F(xiàn)N與α-SMA均為P=0.000)，“TGF-β2+KU-0063794組”中E-cad和Cx43的表達(dá)也高于“TGF-β2+雷帕霉素組”，F(xiàn)N及α-SMA表達(dá)量也低于“TGF-β2+雷帕霉素組”，(E-cad，F(xiàn)N及α-SMA均為P=0.000、Cx43P=0.014)。
　　 結(jié)論：
　　 1、10ng/ml的TGF-β

27、2能有效誘導(dǎo)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化
　　 2、10ng/ml的TGF-β2誘導(dǎo)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化過程中，HLECs內(nèi)mTOR磷酸化激活，但mTOR總量未受影響。
　　 3、10nM的雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制mTOR(S2448-P,S2481-P)的磷酸化水平，且成濃度依賴性，但均不影響mTOR總表達(dá)量。
　　 4、100nM的雷帕霉素和KU-0063794預(yù)處理HLECs均能有效抑制TGF-β

28、2誘導(dǎo)的HLECs內(nèi)mTOR磷酸化激活以及TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化。100nM的雷帕霉素和KU-0063794能部分逆轉(zhuǎn)TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化，但使用100nM雷帕霉素或KU-0063794預(yù)處理再用TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs比先用TGF-β2誘導(dǎo)再使用雷帕霉素或KU-0063794的細(xì)胞更能維持上皮細(xì)胞特性。KU-0063794抑制或者是逆轉(zhuǎn)TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs內(nèi)mTOR(S2448-P,S24