奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中TLR、NOD及其信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)檢測.pdf

1、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白(Nucleotide-binding oligo merization domain protein，NOD)是存在于細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別病原微生物進(jìn)而啟動(dòng)信號(hào)通路，使細(xì)胞釋放炎癥因子，參與先天性免疫反應(yīng)。成纖維細(xì)胞通常是一種不活躍的細(xì)胞，在乳腺中主要起到支持乳腺組織結(jié)構(gòu)和修復(fù)損傷的作用。但是近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥時(shí)成纖維細(xì)胞受

2、到某些刺激變得活躍，活化的成纖維細(xì)胞持續(xù)釋放炎癥因子，使炎癥由急性轉(zhuǎn)為慢性。研究成纖維細(xì)胞免疫的分子作用機(jī)制對(duì)乳腺炎的防控可能具有重要意義。本研究檢測奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中TLR和NOD的表達(dá)情況，并對(duì)細(xì)胞中TLR和NOD信號(hào)通路進(jìn)行研究，從而初步揭示乳腺成纖維細(xì)胞的在先天性免疫方面的作用，為深入研究奶牛乳腺成纖維細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1.奶牛乳腺成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　培養(yǎng)原代奶牛乳腺成纖維細(xì)胞采用組織塊法。根

3、據(jù)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞對(duì)胰酶敏感度不同，差時(shí)消化法連續(xù)純化成纖維細(xì)胞。每天定時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長情況，用純化的成纖維細(xì)胞測生長曲線。吉姆薩染色鑒定細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示:3～5d開始有成纖維細(xì)胞從組織塊周圍向外游出，7d左右可見上皮細(xì)胞爬出組織塊。2種細(xì)胞不混雜生長，存在著明顯的界限。采用差時(shí)消化法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3～5次純化，可得到較為純凈的奶牛乳腺成纖維細(xì)胞。吉姆薩染色觀測細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，邊緣光滑，排列疏松，區(qū)別于上皮細(xì)胞，可確定為奶牛乳

4、腺成纖維細(xì)胞。結(jié)果表明從乳腺組織中成功分離出奶牛乳腺成纖維細(xì)胞。
　　2.奶牛乳腺成纖維細(xì)胞TLRmRNA的表達(dá)及半定量分析
　　RT-PCR檢測脾臟組織中TLR1～TLR10 mRNA表達(dá)情況，應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)分析TLR1～TLR10基因mRNA在奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示TLR1～TLR10在奶牛脾臟和乳腺成纖維細(xì)胞中均表達(dá)，其中TLR1、TLR3、TLR4和TLR5相對(duì)高表達(dá)，而TLR2、TLR

5、6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10相對(duì)低表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)果表明奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中TLR1～TLR10均有不同程度表達(dá)。
　　3.奶牛乳腺成纖維細(xì)胞NOD mRNA的表達(dá)及半定量分析
　　RT-PCR檢測脾臟組織中NOD1和NOD2 mRNA表達(dá)情況，應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)分析NOD1和NOD2基因mRNA在奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，從奶牛脾臟和乳腺成纖維細(xì)胞中分別擴(kuò)增出NOD1和NOD

6、2基因的預(yù)期條帶，NOD2基因mRNA的表達(dá)量相對(duì)高于NOD1(P＜0.05)。結(jié)果表明奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中NOD1和NOD2均有不同程度表達(dá)。
　　4.奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中TLR和NOD信號(hào)通路相關(guān)基因及其下游炎癥因子mRNA表達(dá)檢測
　　采用RT-PCR方法檢測奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中MyD88、TRIF、TRAF6、IRAK1、IRAK4和NF-κB(p65)基因的mRNA表達(dá)，其次檢測細(xì)胞中IL-6、IL-8和TNF-α

7、的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，TLR信號(hào)通路的接頭蛋白MyD88、TRIF、TRAF6、IRAK1和IRAK4，TLR和NOD信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(p65)以及炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α在奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中均表達(dá)。結(jié)果表明乳腺成纖維細(xì)胞中可能存在TLR和NOD信號(hào)通路。
　　5.PAMP誘導(dǎo)對(duì)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中TLR4、NOD2、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)影響
　　分別用lipid A(

8、TLR4配體)和胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）(NOD2配體)誘導(dǎo)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞，RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的TLR4(或NOD2)、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)量變化，結(jié)果顯示，lipid A組TLR4、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA水平與對(duì)照組相比顯著上升(P＜0.05);MDP組NOD2、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA水平與對(duì)照組相比顯著上升(P＜0.05)。說明l