紅曲菌產(chǎn)GABA相關(guān)基因的初步研究.pdf

1、紅曲菌(Monascus spp．)是我國傳統(tǒng)的特色發(fā)酵食品紅曲(red yeast rice，redfermented rice)的生產(chǎn)菌株。紅曲是以大米等為原料，經(jīng)紅曲菌發(fā)酵的產(chǎn)物，在我國有一千多年的應(yīng)用歷史，廣泛用做發(fā)酵劑、食品著色劑和中藥配伍?，F(xiàn)代研究表明，紅曲菌還能產(chǎn)生monaclin K、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、色素以及麥角固醇等多種活性成分。目前，國內(nèi)外對(duì)紅曲菌的誘變、代謝產(chǎn)物分離

2、純化及發(fā)酵條件的研究較多，而有關(guān)紅曲菌的分子生物學(xué)研究才剛剛起步。對(duì)紅曲菌產(chǎn)GABA的研究只限于發(fā)酵條件的優(yōu)化。 本研究首先建立了紅曲中GABA的TLC和HPLC分析方法，然后從課題組前期獲得的53株T-DNA插入突變子中篩選得到10株GABA突變子。在此基礎(chǔ)上，采用TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)分離到了其中3株突變子T-DNA插入位點(diǎn)的左側(cè)序列，并采用RNA干擾(RNA

3、interference，RNAi)對(duì)805<'＃>突變子T-DNA插入位點(diǎn)基因cDNA全長(zhǎng)序列的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下： 1．建立了紅曲中GABA的薄層色譜分析法(TLC)。得到薄層色譜法最佳分析條件是以水為提取劑，V<,95％乙醇：V<,25％氨水>=4：1為展開劑，0.2％茚三酮。無水乙醇溶液為顯色劑，在此條件下，GABA最小檢出量為0.2μg。 2．建立了紅曲中GABA反相高效液相色譜熒光分析法(HPL

4、C-FL)。以鄰苯二甲醛(o-Phthalaldehyde，OPA)柱前衍生，色譜條件為：Chromasil C18(5μm，250×4.6 mm)色譜柱；流動(dòng)相：K<,2>HPO<,4>緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.0)：CH<,3>OH：CH<,3>CN體積比為6：3：1；熒光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)Ex=340 nm，Em=455nm，流速1.0 mL/min，柱溫35℃。該方法在0.1/μmol/L～100μmol/L濃度范圍內(nèi)

5、線性關(guān)系良好，在此濃度范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均回收率分別為0.48％和95.12％。 3．以TLC結(jié)合HPLC-FL為GABA．的篩選方法，從53株T-DNA插入突變子中篩選出10株產(chǎn)GABA發(fā)生明顯差異的突變子，它們分別是189<'＃>、192<'＃>、533<'＃>、635<'＃>、733<'＃>、805<'＃>、1164<'＃>、1263<'＃>、3257<'＃>和4096<'＃>。其中，以1263<'＃>制備的紅曲中G

6、ABA含量最高，達(dá)6.184 mg/g，是對(duì)照菌株M-70.436 mg/g的14.2倍。635<'＃>的最低，僅為0.156 mg/g，約為M-7的0.33倍。同時(shí)測(cè)定了10株突變子紅曲中桔霉素的含量在0.18μg/g～149.51μg/g儋之間。 4．根據(jù)T-DNA上的Gus基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)上述10株GABA突變子進(jìn)行PCR分析，結(jié)果表明它們均含有T-DNA，是T_DNA插入突變子。 5．采用TAIL-PCR對(duì)上述1

7、0株突變子T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行了擴(kuò)增，成功獲得了189<'＃>、805<'＃>和3257<'＃>3株突變子T-DNA插入位點(diǎn)的左側(cè)序列。擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度介于500 bp～1300 bp之間。Blast分析發(fā)現(xiàn)突變子805<'＃>與煙曲霉(Aspoergillusfumigatus)Af293的發(fā)育調(diào)控子FlbA(fluffy for brlA)中G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)子(regulatorfor G-protein signal