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文檔簡(jiǎn)介
1、紅曲霉(Monascus spp.)是我國(guó)傳統(tǒng)的食用和藥用微生物,在我國(guó)已有上千年的應(yīng)用歷史。它能分泌產(chǎn)生色素、莫吶可啉類(lèi)(monacolins)物質(zhì)、γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid,GABA)、麥角固醇和豐富的水解酶類(lèi)等多種有益代謝產(chǎn)物,是生產(chǎn)食品發(fā)酵劑、著色劑、保健食品、藥品或其原料的重要微生物資源。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)紅曲霉菌種的分類(lèi)、選育、代謝產(chǎn)物分離純化及發(fā)酵條件的研究較多,而有關(guān)紅曲霉的分子生物學(xué)研究才剛剛起
2、步。GenBank檢索結(jié)果查見(jiàn),與紅曲霉相關(guān)的核酸序列大部分是研究分類(lèi)和親緣關(guān)系的,有關(guān)功能基因的研究很少,而關(guān)于紅曲霉產(chǎn)色素基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
近年來(lái),利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)T-DNA轉(zhuǎn)化真菌獲得突變體的方法成為尋找和鑒定新基因的有效手段。本課題采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化法建立了包含5100多株轉(zhuǎn)化子的紅曲霉轉(zhuǎn)化子庫(kù),從轉(zhuǎn)化子庫(kù)中篩選得到了24株菌落顏色發(fā)生了
3、明顯變化的色素突變子,并對(duì)其菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)、潮霉素抗性穩(wěn)定性及主要代謝產(chǎn)物的分泌能力等進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上,采用TAIL-PCR分離到8株色素突變子T-DNA插入位點(diǎn)的左側(cè)序列,并應(yīng)用RACE技術(shù)克隆得到了一株色素突變子805#T-DNA插入位點(diǎn)的cDNA全長(zhǎng)序列,采用基因敲除(gene knock-out)技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行了驗(yàn)證。具體研究結(jié)果如下:
1、轉(zhuǎn)化子庫(kù)的構(gòu)建及色素突變株的篩選
通過(guò)優(yōu)化農(nóng)桿菌
4、(A.tumefaciens)介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化紅曲霉的條件,構(gòu)建了包含5100多個(gè)轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化子庫(kù)。T-DNA的PCR驗(yàn)證結(jié)果表明,隨機(jī)挑選的60株轉(zhuǎn)化子均含有T-DNA插入片段。24株隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)化子的Southern雜交結(jié)果表明,T-DNA單拷貝插入率為70.8%。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)的觀察,篩選得到53株形態(tài)發(fā)生明顯變化的轉(zhuǎn)化子,其中24株為菌落顏色發(fā)生顯著變化的色素突變子,其編號(hào)分別為189#、192#、533#、635#、
5、733#、805#、959#、1132#、1164#、1263#、1295#、2066#、2606#、2887#、3108#、3257#、3715#、3742#、4081#、4096#、4591#、4698#、4963#和4968#。色素突變子連續(xù)傳代培養(yǎng)5代后,除733#、1132#、3715#和4591#外,其它20株色素突變子均能在潮霉素抗性培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長(zhǎng),潮霉素抗性穩(wěn)定性達(dá)83.3%。
2、色素突變子產(chǎn)紅曲色素、
6、monacolin K、GABA和桔霉素的分析
采用UV-VIS、TLC、HPLC等方法對(duì)上述20株潮霉素抗性穩(wěn)定的色素突變子的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物紅曲的色素(包括色價(jià)、吸收波長(zhǎng)、色素組分)、monacolin K、GABA和桔霉素的產(chǎn)生情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,與出發(fā)菌株相比,色素突變子產(chǎn)代謝產(chǎn)物的能力都發(fā)生了不同程度的變化。
在產(chǎn)色素方面,色素突變子959#的色價(jià)最高,達(dá)2712,是出發(fā)菌株M-7色價(jià)1228的2
7、.2倍;1263#的色價(jià)最低,僅為20,只有出發(fā)菌株M-7色價(jià)的0.01倍。另外,色素突變子紅曲乙醇萃取液的UV-VIS掃描圖譜和色素組分也發(fā)生了顯著的變化。在產(chǎn)monacolin K方面,突變子4081#紅曲的含量最高,達(dá)1601μg/g,而出發(fā)菌株M-7紅曲的含量低于0.1μg/g。在產(chǎn)GABA方面,突變子1263#紅曲含量最高,達(dá)6183.9μg/g,是出發(fā)菌株M-7436.3μg/g的14.2倍;635#紅曲的含量最低,只有15
8、6.1μg/g,約為出發(fā)菌株M-7的0.33倍。在產(chǎn)桔霉素方面,突變子635#紅曲的含量最高,達(dá)154.57#g/g,是出發(fā)菌株0.75μg/g的206倍;1295#含量最低,為0.10μg/g,為出發(fā)菌株的0.1倍。
比較上述20株色素突變子產(chǎn)色素和桔霉素的情況,可將其分為4類(lèi):第一類(lèi),色價(jià)和桔霉素都升高的,包括635#、959#、1164#、2066#、2606#、2887#、4081#和4698#共8株;第二類(lèi),色價(jià)
9、和桔霉素都降低的,包括805#、1295#、3742#和4968#共4株;第三類(lèi),色價(jià)降低而桔霉素含量升高的,包括189#、192#、1263#和4963#共4株;第四類(lèi),色價(jià)升高而桔霉素降低的,包括533#、3108#、3257#和4096#共4株。從上述四類(lèi)突變子中挑選出635#、1164#、2606#、805#、1295#、189#、1263#、4963#、533#和3257#共10株代表性菌株,作為研究紅曲霉產(chǎn)色素相關(guān)基因的材料
10、。
3、色素突變子T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列TAIL-PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增片段功能分析
采用TAIL-PCR法對(duì)上述10株色素突變子T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行了擴(kuò)增,得到了635#、1164#、2606#、805#、3257#、189#、4963#和533#共8株突變子T-DNA插入位點(diǎn)左側(cè)的DNA序列,擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度介于500bp~1300bp之間。FASTA比對(duì)分析表明,805#突變子DNA擴(kuò)增序
11、列與煙曲霉(Aspergillusfumigatus)Af293的G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)子(regulator for G-protein signaling,RGS)功能域的同源性達(dá)84%;其它7株突變子的T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼的DNA序列未發(fā)現(xiàn)有功能明確的相似性序列。突變子533#、1164#和2606#的DNA擴(kuò)增片段已經(jīng)登陸Genbank,登陸號(hào)分別為DQ861336、DQ861338和DQ1337。
4、紅曲霉G蛋白信號(hào)
12、調(diào)節(jié)子的功能驗(yàn)證
以突變子805#擴(kuò)增序列的Blast比對(duì)分析結(jié)果為依據(jù),設(shè)計(jì)特異性引物,采用RACE技術(shù),擴(kuò)增得到了對(duì)應(yīng)于該DNA序列的2012bp的cDNA序列。ORFfin工具分析顯示,其包含的最長(zhǎng)開(kāi)放讀碼框架(open reading frame,ORE)為1851bp,推衍得到包括了RGS和2個(gè)DEP(disheveled,Egl-10,pleckstrin)3個(gè)結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的氨基酸序列。以RGS結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的DNA
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