空腸彎曲菌生物膜形成特性及相關(guān)基因的初步探析.pdf

1、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是一種重要的人獸共患病原菌，在全球范圍內(nèi)它是引起人類細(xì)菌性腹瀉的主要食源性病原菌之一，更重要的是特定血清型的空腸彎曲菌引起的腸炎是誘發(fā)格林-巴利綜合癥(Guillain Barre Syndrome)的重要前驅(qū)因子。其致病機(jī)制目前還不完全清楚，但它在環(huán)境中的存活和較高的發(fā)病率與其能夠形成生物膜密切相關(guān)，生物膜的形成在空腸彎曲菌傳播感染中扮演了重要的角色。生物膜是微生物在生長過程中為適

2、應(yīng)生存環(huán)境而吸附于生物材料、機(jī)體腔道表面以及其他一些介質(zhì)上，分泌黏性胞外基質(zhì)(extracellular polymeric substance，EPS)將其自身包裹成微菌落，并相互融合形成的高度組織化、系統(tǒng)化的微菌落膜性聚集物。生物膜的特殊結(jié)構(gòu)可以使細(xì)菌耐受消毒劑、冷熱等而得以殘存，造成持續(xù)感染和重復(fù)感染，因此對(duì)于生物膜的基礎(chǔ)研究具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究首先確定了空腸彎曲菌形成生物膜的最佳條件，建立了空腸彎曲菌生物膜形成檢測(cè)方法

3、，對(duì)179株分離株的生物膜形成能力和生物膜形成相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用二維電泳技術(shù)對(duì)空腸彎曲菌生物膜狀態(tài)的蛋白質(zhì)進(jìn)行初步分析，并運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)鑒定出的蛋白點(diǎn)進(jìn)行mRNA水平表達(dá)差異的分析，為進(jìn)一步深入研究空腸彎曲菌生物膜奠定一定的基礎(chǔ)。
　　 研究中，首先采用聚丙乙烯微孔板定量檢測(cè)法對(duì)空腸彎曲菌生物膜進(jìn)行測(cè)定，利用結(jié)晶紫染色法測(cè)定在不同培養(yǎng)時(shí)間、氧氣濃度、溫度、培養(yǎng)基條件下生物膜的形成情況，結(jié)果表明:在37℃、10％

4、O2培養(yǎng)條件下，用MH肉湯培養(yǎng)72h的空腸彎曲菌能夠形成較為成熟的生物膜。隨后還通過試管法、普通顯微鏡法和掃描電子顯微鏡法來檢測(cè)觀察空腸彎曲菌生物膜的形成，結(jié)果顯示:空腸彎曲菌在試管的氣液交界面容易形成生物膜，且通過結(jié)晶紫染色后能夠清楚地觀察到生物膜的形成;利用剛果紅/石碳酸品紅染色后用普通光學(xué)顯微鏡能夠直接觀察到生物膜的結(jié)構(gòu);通過掃描電子顯微鏡可以觀察到更為直觀、立體的生物膜的結(jié)構(gòu)，甚至細(xì)微的結(jié)構(gòu)。在實(shí)際檢測(cè)時(shí)可以根據(jù)不同的情況來選擇

5、不同的檢測(cè)方法。
　　 利用聚丙乙烯微孔板定量測(cè)定法對(duì)179株不同源空腸彎曲菌分離株進(jìn)行生物膜形成能力的測(cè)定，根據(jù)OD值將菌株分為:弱生物膜形成能力、中等生物膜形成能力和強(qiáng)生物膜形成能力。結(jié)果顯示:弱生物膜形成能力的菌株共有60株，中等生物膜形成能力的菌株有69株，50株具有強(qiáng)生物膜形成能力。而不同源的分離株生物膜形成能力分布與總體趨勢(shì)類似，不同源菌株之間生物膜形成能力沒有顯著差異。
　　 利用空腸彎曲菌的兩種敏感抗生素

6、:頭孢噻肟和鏈霉素，分別測(cè)定其對(duì)空腸彎曲菌懸浮菌和生物膜狀態(tài)的MBC(最低殺菌濃度)，并進(jìn)行比較。結(jié)果顯示:生物膜狀態(tài)下的空腸彎曲菌較懸浮狀態(tài)，兩種抗生素的MBC均呈數(shù)倍提高。這也一定程度上說明生物膜的形成也是空腸彎曲菌耐藥的一個(gè)重要因素。
　　 研究中根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇9個(gè)與生物膜形成相關(guān)的基因:flaA(鞭毛蛋白基因)、fliA(鞭毛生物合成因子)、Luxs(與群體反應(yīng)有關(guān)的基因)、rpoN(類似于影響腸炎沙門菌生物膜相關(guān)基因

7、rpoS的RNA聚合酶因子)、cmec(外膜通道蛋白)、cadF(黏附基因)、racR(黏附定植相關(guān)基因)、peb1A(黏附蛋白基因)、Peb4(細(xì)胞間結(jié)合蛋白相關(guān)基因)。對(duì)179株不同源空腸彎曲菌分離株進(jìn)行生物膜相關(guān)基因的檢測(cè)，選定的9個(gè)基因在各個(gè)生物膜形成能力類別中均有較高的檢出率，單獨(dú)基因和生物膜形成能力之間沒有絕對(duì)直接的正負(fù)表達(dá)關(guān)系，這也從一定程度上揭示了生物膜的形成是多種基因協(xié)同表達(dá)調(diào)控的結(jié)果。
　　 另外，本研究制備

8、了空腸彎曲菌NCTC11168懸浮狀態(tài)和生物膜狀態(tài)的細(xì)菌，并提取菌體蛋白，應(yīng)用固相pH梯度二維凝膠電泳獲得了重復(fù)性較好的2-DE凝膠圖譜，利用PDQuest軟件篩選出差異蛋白質(zhì)，選取了部分差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)分析獲得肽質(zhì)量指紋圖譜，利用MASCOT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，獲得所鑒定蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息。通過質(zhì)譜鑒定，得到的10個(gè)差異蛋白，涉及生物合成類的有4個(gè)，氧化還原酶類有2個(gè)，轉(zhuǎn)移