紅曲霉色素合成相關(guān)基因的篩選.pdf

1、紅曲霉（Monascus spp.）作為一類天然色素和功能性食品添加劑的發(fā)酵菌株應(yīng)用廣泛，尤其是在亞洲的許多國家。紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的色素具有許多對(duì)人體有用的特性，例如消炎、減肥、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及抗癌的有益功效。除了色素以外，紅曲霉的其他次級(jí)代謝產(chǎn)物，如莫納可林K，γ-氨基丁酸(GABA)等也具有降血壓、降血脂、抗氧化、抗癌及免疫調(diào)節(jié)的功能。但是隨之產(chǎn)生的真菌毒素-桔霉素嚴(yán)重的阻礙了這些有益的紅曲發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用和出口。到目前為止，與紅曲霉

2、次級(jí)代謝產(chǎn)物及其調(diào)控機(jī)制有關(guān)的分子生物學(xué)信息比較匱乏，對(duì)于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)色素沒有很好地指導(dǎo)作用，因此從分子水平揭示紅曲霉的代謝調(diào)控機(jī)制就顯得尤為重要。在本研究中，通過雙向電泳技術(shù)分析產(chǎn)色素水平差異較大的兩組菌體，從而篩選與色素合成相關(guān)的基因并通過基因敲除的技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大米、果糖、蔗糖、淀粉、葡萄糖和麥芽糖這六種碳源進(jìn)行色素規(guī)律的研究，這六種培養(yǎng)基大米產(chǎn)色素能力最強(qiáng)，然后依次是果糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖，產(chǎn)色素能力

3、最低的是蔗糖。通過比較各種培養(yǎng)基和色素的關(guān)系最終選定淀粉和蔗糖分別作為高產(chǎn)和低產(chǎn)色素培養(yǎng)基的碳源。選取第8天進(jìn)行全蛋白的分析，其中淀粉作為主要碳源產(chǎn)生紅、橙、黃三種色素的色價(jià)分別為3442.25 U/g、3148.13 U/g、3703.43 U/g;蔗糖作為主要碳源產(chǎn)生三種色素的色價(jià)分別為555.49 U/g、396.66 U/g、1001.28 U/g。通過雙向電泳找到了72個(gè)差異點(diǎn)，通過質(zhì)譜鑒定64個(gè)蛋白點(diǎn)被成功鑒定出來。對(duì)這些差

4、異蛋白進(jìn)行相似的數(shù)據(jù)分析與資料查閱，得到了11個(gè)與色素合成相關(guān)的蛋白。
　　為了驗(yàn)證與色素合成相關(guān)的基因，選取c5.123(salicylate hydroxylase)和c5.133(Aflatoxin B1 aldehyde reductase)兩個(gè)基因進(jìn)行敲除。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出含有特定酶切位點(diǎn)的上下游片段，利用重組DNA技術(shù)將上下游連接到pUCH2-8載體的潮霉素基因兩端，成功構(gòu)建出高特異性的長片敲除載體。其中c