益氣活血方聯(lián)合MSCs移植對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠模型bFGF基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的:通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)制備純度較高的MSCs和完善更加科學(xué)的中藥提取方法;制備SD大鼠短暫性腦缺血再灌注損傷(I/R)模型。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ凸辔钢苽涞囊鏆饣钛胶徒?jīng)動(dòng)脈移植MSCs后,應(yīng)用RT-PCR和電泳的方法檢測(cè)短暫性腦缺血再灌注損傷病灶組織堿性成纖維生長(zhǎng)因子(BasicFibroblastGrowthFactor,bFGF)mRNA的表達(dá)。來(lái)評(píng)價(jià)益氣活血方聯(lián)合動(dòng)脈移植MSCs對(duì)腦缺血損傷的作用,來(lái)探討益氣活血方和MSCs移植促進(jìn)堿性成纖

2、維生長(zhǎng)因子在短暫性腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。
　　方法:清潔級(jí)成年健康SD大鼠,無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨,DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓,目鋼網(wǎng)過(guò)濾。然后用密度梯度離心法分離獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononuclearcells,MNCs),PBS洗兩次,將沉淀物加入含％FBS的DMEM培養(yǎng)液ml,輕輕吹打,做成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),稀釋,按設(shè)計(jì)密度接種于T-75培養(yǎng)瓶中,置于℃、體積分?jǐn)?shù)為%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪

3、滿瓶底后用%胰蛋白酶消化傳代,取第七代凍存移植。
　　采用“線栓法”制備SD大鼠短暫性腦缺血再灌注損傷模型,模型分為空白組、對(duì)照組、MSCs移植治療組和益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組,每組只。在造模缺血小時(shí)再灌注天后,取各組造模成功的不同給藥:益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組和MSCs移植治療組經(jīng)頸動(dòng)脈注入MSCs懸液,空白組、對(duì)照組經(jīng)頸動(dòng)脈注入等量生理鹽水。腦缺血模型空白組、對(duì)照組和MSCs移植組分別灌胃生理鹽水(ml/kg體

4、重),聯(lián)合組按同等的相應(yīng)藥量灌服益氣活血湯藥。各組在造模前天開始給藥,每日一次,連用天。結(jié)束后斷頭取腦,取缺血再灌注損傷病灶處腦組織放入液氮中-80℃保存。
　　應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)RT-PCR方法:用TRIzol法從組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。檢測(cè)bFGF在短暫腦缺血再灌注損傷的表達(dá)。結(jié)合運(yùn)用現(xiàn)代圖像軟件處理技術(shù)并對(duì)密度掃描分析以反映bFGFmRNA

5、相對(duì)水平,觀察各組的bFGF表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組(n=8),表達(dá)水平為(4.38±.32),和空白組(n=7,.04±.27)相比顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02,P＜0.05);
　　2.對(duì)照組(n=8,.17±.34)與益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組與相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),MSCs移植治療組(n=7,.92±.77)與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

6、＜0.05);
　　3.益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組bFGF表達(dá)高于MSCs移植治療組,腦缺血對(duì)照組的變化與空白組相似,同一時(shí)間點(diǎn)相比較,均顯著低于MSCs移植治療組。益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組bFGF高表達(dá);空白組和對(duì)照組SD大鼠腦組織僅有bFGF輕微表達(dá),相比差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.采用密度梯度離心法能夠去除骨髓中的絕大多數(shù)紅細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和血小板,分離獲取單核細(xì)胞,經(jīng)原代培養(yǎng)

7、和不斷的傳代獲取純度較高的MSCs。
　　2.應(yīng)用藥物分析化學(xué)的方法對(duì)益氣活血湯藥分別提取芳香水,減壓濃縮制備。方法更先進(jìn),有效成分不易丟失,提高了藥物的生物利用度,更有利于吸收;降低了灌胃量,不適反應(yīng)大大減少。
　　3.短暫性腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的制備采用改良線栓法取得了較好效果,神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分理想,癥狀很接近人表現(xiàn)。其簡(jiǎn)便、易行,容易操作,很具有實(shí)用性,是制作腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型理想的方法。
　　4.應(yīng)用R

8、T-PCR和電泳檢測(cè)是可行有效的方法,證明了益氣活血方和MSCs移植治療短暫性腦缺血再灌注損傷可能通過(guò)誘發(fā)促進(jìn)腦內(nèi)bFGF的高水平表達(dá),激活內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制,使它在保護(hù)病灶周圍神經(jīng)元、促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)中可能發(fā)揮著重要作用。中藥聯(lián)合MSCs移植可對(duì)腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用,促內(nèi)源性bFGF表達(dá)可能是其機(jī)制之一。
　　5.通過(guò)中藥的應(yīng)用和外源性MSCs移植治療腦缺血再灌注損傷后的機(jī)制是整體協(xié)同作用,為中藥聯(lián)合干細(xì)胞的臨床應(yīng)用