益氣活血復(fù)方芪丹通脈片對腦缺血再灌注損傷的保護作用及拆方研究.pdf

1、目的：缺血性腦血管病是臨床常見病，具有致殘率高、死亡率高的特點，近年來該病的發(fā)病率有升高的趨勢。隨著溶栓療法的應(yīng)用，再灌注損傷的問題越來越受到重視。研究表明，腦缺血再灌注損傷與神經(jīng)細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、鈣超載、氧自由基的產(chǎn)生、興奮性氨基酸的毒性作用等密切相關(guān)。腦缺血再灌注損傷的防治成為廣大學(xué)者普遍關(guān)注的問題。中醫(yī)學(xué)認為，缺血性腦血管病屬“中風(fēng)”、“卒中”“偏枯”范疇，主要病機為氣虛血瘀，臨床多采用益氣活血為主要治則。芪丹通脈片由黃芪、丹參

2、、紅花、當歸、桂枝組成，具有益氣活血、溫通經(jīng)脈功效，臨床治療缺血性中風(fēng)，療效頗佳。本實驗應(yīng)用腦缺血再灌注大鼠模型，探討芪丹通脈片對腦缺血再灌注損傷的影響及分子機制，為其治療缺血性腦卒中提供實驗依據(jù)。同時中藥復(fù)方的組方原理具有深刻的科學(xué)內(nèi)涵，拆方是研究中藥復(fù)方組方原理的重要手段之一。因此本實驗還擬通過比較芪丹通脈片及拆方(益氣組、活血組)對腦缺血再灌注的影響，探討該方的組方原理。 方法： 線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞局灶性

3、腦缺血再灌注模型。研究內(nèi)容共分三部分。(1)芪丹通脈片對腦缺血再灌注損傷保護作用的研究：健康雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、芪丹通脈片低劑量組、芪丹通脈片中劑量組、芪丹通脈片高劑量組、陽性對照尼莫地平組。各組大鼠于腦缺血2h再灌注24h后先進行神經(jīng)功能缺損評分，處死后行TTC和HE染色，測定腦梗死體積及觀察病理學(xué)改變。(2)芪丹通脈片及拆方對腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡及相關(guān)基因表達的影響：大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、黃芪組、活血

4、組(即丹參、當歸、紅花、桂枝合用組)及芪丹通脈片總方組，采用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法檢測各組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡；免疫組化法結(jié)合圖像分析檢測凋亡相關(guān)基因Bc卜2、Fas-L的表達。(3)芪丹通脈片及拆方對腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)及相關(guān)細胞因子含量的影響：大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、黃芪組、活血組(即丹參、當歸、紅花、桂枝合用組)及芪丹通脈片總方組，分光光度法檢測各組大鼠腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性；酶聯(lián)免

5、疫吸附法檢測大鼠腦組織白細胞介素-6(IL-6)含量。 結(jié)果： 1.模型組大鼠腦組織梗死灶體積最大，病理上呈典型的缺血壞死性改變，神經(jīng)功能缺損評分最高。芪丹通脈片低、中、高劑量組與尼莫地平組的腦梗死體積均較模型組減小(P＜0.01)，病理改變較模型組減輕，神經(jīng)功能缺損評分降低，且劑量越大，效果越明顯。其中高劑量組與尼莫地平組比較無顯著性差異(P＞0.05)。 2.與假手術(shù)組相比，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織凋亡神經(jīng)細胞

6、及Bcl-2、Fas-L蛋白表達增強(P＜0.01)。與模型組相比，芪丹通脈片總方組與黃芪組、活血組大鼠缺血側(cè)腦組織凋亡神經(jīng)細胞表達降低，Bcl-2蛋白陽性細胞表達增多(P＜0.01)，F(xiàn)as-L陽性細胞表達減少(P＜0.01或P＜0.05)，且與拆方組比較，總方組的作用最強(P＜0.05或P＜0.01)。 3.與假手術(shù)組相比，模型組缺血側(cè)腦組織MPO活性顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比，黃芪組、活血組、芪丹通脈片總方組大

7、鼠缺血側(cè)腦組織MPO活性降低(P＜0.01)，芪丹通脈片總方組MPO活性較黃芪組、活血組明顯降低(P＜0.01)。假手術(shù)組腦組織中未檢測出IL-6，模型組IL-6含量升高明顯(P＜0.01)。黃芪組、活血組、芪丹通脈片總方組IL-6含量均較模型組升高(P＜0.01)，其中總方組作用較黃芪組、活血組更顯著(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.神經(jīng)功能缺損評分是評價腦缺血損害重要的終末指標之一。腦梗死體積和腦缺血后的組織病理學(xué)改變

8、是評價局部腦缺血及缺血性腦損害程度重要的客觀指標，也是證實藥效學(xué)的最可靠指標。實驗發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量芪丹通脈片均能使缺血性腦組織病理變化減輕，腦梗死體積縮小，神經(jīng)功能缺損評分降低，且其效果與用量呈量效關(guān)系。實驗結(jié)果顯示芪丹通脈片對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。 2.神經(jīng)細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要環(huán)節(jié)，是一種受基因調(diào)控的自主性、程序性細胞死亡過程。與凋亡相關(guān)的基因包括抑凋亡基因、促凋亡基因。Bcl-2是抑制細胞凋亡的重要基因

9、之一，F(xiàn)as-L被認為是主要的凋亡促進基因。實驗結(jié)果顯示芪丹通脈片及其拆方可促進Bcl-2蛋白的表達，下調(diào)Fas-L蛋白的表達，從而抑制缺血再灌注腦組織的神經(jīng)細胞凋亡，這可能是芪丹通脈片對腦缺血再灌注損傷起神經(jīng)保護作用的機理之一。芪丹通脈片總方組的作用明顯優(yōu)于其拆方組，說明方中益氣、活血中藥配伍具有協(xié)同作用。 3.炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的另一主要環(huán)節(jié)。中性粒細胞的粘附和浸潤是炎癥反應(yīng)的核心，MPO活性是評價中性粒細胞在組織中