卡那霉素對(duì)乙酰膽堿調(diào)節(jié)耳蝸外毛細(xì)胞的影響.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文卡那霉素對(duì)乙酰膽堿調(diào)節(jié)耳蝸外毛細(xì)胞的影響姓名：高青華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生理學(xué)指導(dǎo)教師：湯浩20090401強(qiáng)度由95dBSPL開始，按5dBSPL逐檔遞減，聽閾判斷以ABR的P3波為準(zhǔn)。3、耳蝸基底膜鋪片硝酸銀染色檢測(cè)外毛細(xì)胞將各組豚鼠斷頭取聽泡，暴露耳蝸，從蝸尖向蝸內(nèi)輕輕推注05％的AgN03溶液5ml，置于05％AgN03溶液中15min，蒸餾水漂洗，用4％多聚甲醛溶液固定4h以上，同時(shí)在日光下曝光11

2、5h，然后在解剖顯微鏡下分離基底膜，置于載玻片上，用甘油蓋玻片封片鏡檢，觀察各組外毛細(xì)胞分布及形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。4、免疫組化檢測(cè)耳蝸乙酰膽堿酯酶(acetyrlcholinesterase，ACHE)表達(dá)各組豚鼠停藥并測(cè)試完ABR后，立即斷頭處死，速取聽泡，經(jīng)固定、脫鈣后行石蠟包埋，平行蝸軸連續(xù)切片，將各組切片進(jìn)行AChE免疫組織化學(xué)染色，陰性對(duì)照組用PBS代替一抗，其他不變。檢測(cè)時(shí)，將切片置于顯微鏡下，每張切片均取柯蒂氏器作為視野，數(shù)碼相機(jī)

3、拍照，用顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各組AChE陽(yáng)性反應(yīng)的平均灰度值?；叶戎翟叫。硎娟?yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)。5、外毛細(xì)胞的急性分離將豚鼠迅速斷頭處死，取出兩側(cè)聽泡，在人工外淋巴液中打開聽泡，剔除耳蝸骨殼，切下二至頂轉(zhuǎn)耳蝸，放入含有025％胰蛋白酶的無(wú)鈣人I#b淋巴液中，溫度為2025℃，消化lOmin棄去酶液，人工外淋巴液反復(fù)沖洗三次以終止消化。用細(xì)口徑吸管反復(fù)吹打至細(xì)胞離散，將OHC懸液放人冰箱(4℃)或置室溫保存。6、熒光測(cè)鈣選擇分離活性好的OHC

4、，按以下分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：①對(duì)照組、②Ach組、③ACh卡那霉素組。OHC懸液中加入Fluo一3／AM避光孵育30min，用顯微熒光測(cè)鈣系統(tǒng)檢鋇lJFluo3熒光強(qiáng)度的變化。熒光圖象記錄于計(jì)算機(jī)中，用配套軟件分析熒光強(qiáng)度變化，熒光強(qiáng)度表示游離鈣濃度的高低。7、統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x壇)表示，用excel軟件進(jìn)行f檢驗(yàn)。結(jié)果1、ABR閾值檢測(cè)用藥前各組豚gABR閾值無(wú)顯著性差異(胗O05)；用藥后卡那霉素給藥3天組ABR閾值無(wú)明