乙酰膽堿M受體調控小膠質細胞免疫應答作用研究.pdf

1、阿爾茲海默癥（AD）是發(fā)生在老年期及老年前期的一種慢性退化性腦變疾病，以進行性記憶減退、認知障礙、人格改變?yōu)榕R床表現(xiàn)。在人口老齡化的當代社會，AD成為繼心腦血管疾病，腫瘤和腦卒中的第四大殺手，威脅著老年人身體健康，降低了生活質量，加重家庭和社會負擔。AD發(fā)病原因復雜多樣，目前具體發(fā)病機制仍不明確。
　　近年研究發(fā)現(xiàn)，神經炎癥反應是AD的一個重要的致病原因。AD患者腦內小膠質細胞（MG）高度活化，炎性因子含量增高。作為神經炎性的始作

2、俑者，MG免疫功能的調控成為AD治療的新靶點，其免疫功能的研究也躋身于神經退行性疾病領域的研究熱點。MG在CNS中的作用是把雙刃劍，激活的MG吞噬細胞殘渣，通過抗原遞呈功能、細胞因子分泌參與免疫應答反應，移除病原體。然而，MG過度激活導致CNS發(fā)生慢性炎癥，加重大腦損傷。因此，嚴格調控MG免疫反應是防止神經炎性發(fā)生的關鍵。
　　乙酰膽堿是一類參與中樞大腦學習、認知、記憶等的重要神經遞質，乙酰膽堿作用的受體包括毒蕈堿型膽堿受體（mA

3、ChRs）和煙堿型膽堿受體（nAChRs）。近年來研究表明，乙酰膽堿系統(tǒng)中nAChRs在MG介導的神經炎性發(fā)揮作用，а7煙堿型受體（а7nAChR）在MG表達，激活а7nAChR抑制MG的炎性反應。然而，mAChRs在MG的表達情況以及是否參與MG的炎性調控尚不清楚。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠長期腹腔注射mAChRs非選擇性拮抗劑鹽酸苯海索（THP）促進大腦海馬和皮層的MG增生和激活，上調MG的CD68表達同時伴隨M1受體表達增加，

4、并且兩者存在共定位，暗示M受體介導THP對MG活化的調控作用。在本研究中，將首次確證mAChRs在MG的表達情況，并且觀察mAChRs對MG免疫應答功能的調控作用。本研究的開展利于探討mAChRs與神經炎性的關系，開拓了其影響AD發(fā)展的新機制研究,有利于尋找治療AD的新靶點。
　　首先建立原代大鼠皮層小膠質細胞培養(yǎng)方法，在體外條件下，確證mAChRs在小膠質細胞表達情況；利用mAChRs非選擇性激動劑氧化震顫素（OX）、mAChR

5、s非選擇拮抗劑阿托品和M1受體阻斷劑毒蕈堿毒素7（MT7）三種工具藥，研究mAChRs對小膠質細胞抗原遞呈功能、小膠質細胞活化和免疫炎癥介質釋放的調控作用。
　　方法：
　?。?）建立大鼠皮層原代小膠質細胞培養(yǎng)方法：將出生12 h內的SD大鼠的皮層神經膠質細胞混合培養(yǎng)8-9天，小膠質細胞分層明顯且數(shù)量達到最多，利用胰酶溫和消化法和震搖法進行小膠質細胞分離純化；純化的小膠質細胞培養(yǎng)3天后基本恢復靜息狀態(tài)，通過小膠質細胞標記分子

6、Iba1免疫熒光染色進行鑒定。
　?。?）mAChRs在小膠質細胞表達研究：利用RT-PCR、Western-blot技術從mRNA和蛋白水平檢測mAChRs在小膠質細胞表達情況。
　?。?）mAChRs對小膠質細胞抗原遞呈功能影響研究：mAChRs非選擇性激動劑OX處理小膠質細胞，利用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）結合免疫熒光、流式細胞術觀察OX對主要組織相容性抗原分子Ι（MHCΙ）表達影響；熒光定量PCR檢測OX對小膠

7、質細胞抗原遞呈分子相關基因Rt1-Aw2、β2m和Tap1 mRNA表達影響。
　?。?）M1受體參與mAChRs調控小膠質細胞抗原遞呈作用研究：利用M1受體阻斷劑MT7，應用免疫熒光結合CLSM、Western-blot和熒光定量PCR檢測MT7對小膠質細胞MHCΙ分子和M1受體表達的變化。
　?。?）mAChRs對小膠質細胞活化的影響：免疫熒光結合CLSM和Western-blot檢測OX單獨給藥以及MT7和OX伴隨給藥

8、對小膠質細胞激活分子CD68和CD11b表達影響。
　?。?）mAChRs對小膠質細胞炎癥介質釋放影響：Luminex技術檢測OX對小膠質細胞IL-1β、TNF-а和IL-10釋放的影響。
　　結果：
　?。?）改進了原代小膠質細胞的培養(yǎng)方法，小膠質細胞Iba1陽性率高達95％；觀察了小膠質細胞生長規(guī)律，神經膠質細胞混合培養(yǎng)時小膠質細胞呈現(xiàn)阿米巴樣，分離純化3天后基本恢復分枝狀；
　?。?）RT-PCR結果表明，

9、mAChRs五種亞型受體mRNA均在小膠質細胞表達，免疫熒光結合CLSM分析和Western-blot結果顯示M1受體表達于小膠質細胞，并且定位在胞膜和胞漿；
　?。?）免疫熒光結合CLSM分析發(fā)現(xiàn)，正常組小膠質細胞MHCΙ表達量較少，OX（10-5 M）與小膠質細胞共同孵育72 h，MHCΙ表達顯著上調；
　?。?）流式細胞術結果表明，正常組小膠質細胞膜共標記MHCΙ和β2m的細胞陽性率為8.46±0.47%，OX組β2m

10、和MHCΙ共標記細胞陽性率為51.80±1.48%，與正常組比較，OX組顯著增加了5倍，表明OX促進小膠質細胞膜功能性MHCΙ表達；
　?。?）熒光定量PCR結果發(fā)現(xiàn)，OX促進抗原遞呈分子相關基因Rt1-Aw2、β2m和Tap1 mRNA表達；
　?。?）免疫熒光結合CLSM分析表明，OX（10-5 M，40 min）同時上調小膠質細胞MHCΙ和M1受體表達，MT7（10-8 M）預處理小膠質5 min，部分阻斷OX誘導的M

11、HCΙ和M1受體表達；并且M1受體與MHCΙ存在共定位，提示M1受體參與OX上調MHCΙ表達；
　　（7）OX動態(tài)影響小膠質細胞M1受體表達：CLSM結合Western-blot結果顯示， OX（10-5M，72 h）上調M1受體表達;熒光定量PCR結果表明，OX（10-5M，20 min）抑制M1受體mRNA表達, OX（40 min和72 h）促進M1受體mRNA表達，MT7部分阻斷OX誘導的M1受體mRNA表達；
　　

12、（8）CLSM分析和western-blot結果顯示，OX（10-5 M，72 h）上調小膠質細胞激活分子CD68和CD11b表達，表明OX促進小膠質細胞活化；MT7部分阻斷OX對兩者表達的誘導作用；提示M1受體直接調控小膠質細胞活化;
　?。?）OX（10-6 M，10-4 M）與小膠質細胞共同孵育24 h，小膠質細胞TNF-а和IL-10釋放減少，OX對IL-1β釋放無明顯影響。
　　結論：
　?。?）成功改進了原