卡那霉素致小鼠耳毒性的分子機制-耳蝸外毛細胞馬達蛋白Prestin的參與作用.pdf

1、目的：
　　 建立卡那霉素致小鼠耳毒性模型;明確小鼠耳毒性模型中,卡那霉素對耳蝸外毛細胞基底部外側膜上表達的馬達蛋白Prestin直接作用及其特點;探討小鼠耳毒性模型中,卡那霉素耳毒性作用引起耳蝸內(nèi)組織細胞的凋亡、凋亡信號轉導途徑及其發(fā)生特點;探討卡那霉素所致的耳蝸內(nèi)細胞凋亡與Prestin蛋白表達及功能之間的關聯(lián);建立轉染Prestin基因的細胞株CHO-K1,在體外情況下,研究卡那霉素及細胞外的氯離子濃度對轉染Prestin

2、細胞的膜電位及細胞內(nèi)的氯離子濃度的影響,從而進一步評估這些因素對Prestin功能的影響。
　　 方法：
　　 1、建立卡那霉素誘導產(chǎn)生的BALB/c小鼠耳毒性模型。
　　 2、聽覺腦干反應(ABR)的檢測:采用tone-pip聲刺激,檢測小鼠耳毒性模型在不同刺激聲頻率上的聽覺閾值的變化,用以客觀評估卡那霉素給藥組與對照組的小鼠的聽覺功能變化及其二者間的差異;
　　 3、免疫組織化學:應用耳蝸石蠟切片與免

3、疫組織化學方法,探討耳毒性引起的耳蝸外毛細胞的損害與對Prestin蛋白的影響二者間的關聯(lián);耳蝸基底膜硬鋪片、原位免疫熒光染色、激光共聚焦顯微成像技術相結合,以觀察耳蝸外毛細胞馬達蛋白Prestin的表達與耳毒性之間的相關性;采用耳蝸石蠟切片、TUNEL與免疫組織化學方法,研究卡那霉素耳毒性過程中,耳蝸內(nèi)組織細胞的凋亡、凋亡信號轉導途徑及凋亡發(fā)生的特點。
　　 4、Real-timePCR檢測:在卡那霉素不同用藥時間組的小鼠耳蝸

4、內(nèi),檢測Prestin蛋白的RNA表達量,以觀察卡那霉素在分子水平上對Prestin蛋白的作用;檢測不同用藥時間組的小鼠耳蝸內(nèi)miR-34a,miR-34c的表達,研究二者是否參與了AmAn的耳毒性所導致的耳蝸內(nèi)組織細胞凋亡的調(diào)控過程。
　　 5、轉染Prestin-pcDNA3.1(-)的質(zhì)粒到細胞株CHO-K1,通過藥物篩選建立體外高表達Prestin蛋白的細胞株,并采用熒光探針染料標記結合顯微熒光成像記錄技術,研究卡那霉素

5、及細胞外的氯離子濃度對高表達Prestin蛋白的細胞膜電位與細胞內(nèi)的氯離子濃度的影響。通過卡那霉素體外誘導轉染細胞的凋亡,觀察Prestin蛋白與細胞凋亡之間的關系。
　　 結果：
　　 1、成功建立卡那霉素致BALB/c小鼠耳毒性模型。
　　 2、在卡那霉素所致的小鼠耳毒性過程中,用藥組小鼠的各刺激聲頻率上的ABR閾值上移,與用藥時間呈正相關性,而對照組的ABR聽覺閾值則沒有明顯變化;用藥10天后,用藥組與對照

6、組間ABR聽覺閾值存在極顯著性差異;高頻率(≥24kHz)的ABR聽覺閾值較早(用藥7天后)發(fā)生改變,而低頻率(≤8kHz)的ABR聽覺閾值改變則相對較晚。
　　 3、耳蝸外毛細胞的損害程度與用藥時間之間具有正相關性;外毛細胞馬達蛋白Prestin的表達量及表達位置發(fā)生變化;Prestin蛋白的RNA表達量也受到卡那霉素耳毒性的影響,表達量減少,與用藥時間之間存在著負相關性。
　　 4、各用藥組的耳蝸石蠟切片TUNEL檢

7、測,顯示耳蝸內(nèi)組織細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,且與用藥時間呈一定的正相關性。
　　 5、免疫組織化學檢測凋亡信號途徑,以Calpain介導的細胞凋亡信號最為明顯,Calpain蛋白的表達與用藥時間呈一定的正相關性。
　　 6、Real-time PCR檢測參與細胞凋亡調(diào)控的miR-34a在耳蝸內(nèi)表達量與用藥劑量呈正相關性;而另一參與細胞凋亡調(diào)控的小分子RNA-miR-34c的表達在用藥組與對照組之間比較無顯著性差異。
　　

8、 7、卡那霉素作用于轉染后高表達Prestin蛋白的CHO-K1細胞,能夠使細胞內(nèi)的氯離子濃度升高,細胞膜電位去極化;去除細胞外溶液的氯離子,也能夠使細胞膜電位去極化,細胞內(nèi)的氯離子濃度輕微升高;Prestin轉染組和對照組之間比較,卡那霉素與去除細胞外的氯離子對細胞膜電位的影響無顯著差異性,去除細胞外的氯離子對于細胞內(nèi)的氯離子濃度的改變也無差異性,但卡那霉素升高細胞內(nèi)的氯離子濃度卻在兩組之間存在著極顯著性差異。
　　 8、卡那

9、霉素作用于轉染細胞,可引起細胞的凋亡,與用藥時間呈正相關性;轉染Prestin的細胞的凋亡率明顯高于對照組。
　　 討論：
　　 我們的研究表明,在卡那霉素所致小鼠耳毒性模型中,模型小鼠的聽覺ABR閾值上移,高頻率閩值改變早于低頻率閾值改變,這是由于卡那霉素的耳蝸毒性損害是先從耳蝸基底部開始,并向耳蝸頂部發(fā)展,而耳蝸基底部主要是對高頻聲敏感,耳蝸頂部則是對低頻聲敏感,因此卡那霉素耳毒性損害先影響高頻段聽覺,后作用于低頻段

10、聽覺。
　　 實驗結果顯示,在卡那霉素的耳毒性過程中,外毛細胞及其它一些內(nèi)耳組織細胞發(fā)生了凋亡性死亡,Calpain信號轉導途徑是其中一個重要的凋亡途徑,這可能是由于卡那霉素的耳毒性作用使得細胞內(nèi)的鈣離子濃度升高,致Calpain蛋白過度激活,引起細胞骨架和細胞膜的崩潰,膜蛋白,各種激酶,磷酸酶以及轉錄因子都受到嚴重影響,最終導致細胞凋亡。
　　 研究已經(jīng)表明,細胞內(nèi)的氯離子濃度對于Prestin蛋白功能具有重要影響,細

11、胞內(nèi)的氯離子可以作為Prestin蛋白的“電壓感受器”,感受細胞膜電位變化,促進Prestin蛋白的構象改變。將細胞內(nèi)的氯離子完全去除后,Prestin蛋白的功能則全部喪失,由此可知,細胞內(nèi)的氯離子濃度的變化對于Prestin蛋白功能具有直接的影響。細胞膜電位的變化也對Prestin蛋白的功能至關重要。當細胞膜電位去極化時Prestin蛋白“收縮”,導致細胞“縮短”;反之當細胞膜電位超極化時,Prestin蛋白“伸長”,細胞則伸長。因此

12、通過觀察卡那霉素作用于高表達Prestin蛋白的細胞,細胞膜電位以及細胞內(nèi)的氯離子濃度的變化,以此間接地評估對Prestin蛋白功能的影響。除了研究卡那霉素對細胞的直接作用外,還通過改變細胞外的氯離子濃度,觀察對轉染細胞的細胞膜電位及細胞內(nèi)的氯離子濃度影響。
　　 實驗結果顯示,卡那霉素可以直接影響細胞膜電位,使細胞膜電位去極化,但作用在Prestin轉染組與對照組細胞之間沒有明顯差別,表明卡那霉素對細胞膜電位的影響是非特異性的

13、。這種作用可能是由于卡那霉素與細胞膜上的磷酸肌醇相結合后,導致細胞內(nèi)的鈣離子濃度升高,細胞去極化。
　　 因此我們認為,AmAn的急性耳毒性作用很可能是由于它們引起外毛細胞的膜電位及細胞內(nèi)的氯離子濃度改變,直接或間接地導致外毛細胞膜上的Prestin蛋白的功能受到了影響,而這種急性耳毒性作用是快速、可逆的,隨著停藥后耳蝸內(nèi)的AmAn逐漸清除,外毛細胞恢復正常狀態(tài)和功能,受損的聽覺功能逐漸恢復。至于長期應用AmAn所引起的耳毒性作

14、用,則是由于激活了其它的損傷應激機制,如細胞的凋亡,外毛細胞凋亡壞死,缺失,Prestin蛋白表達位置發(fā)生改變,表達量減少,功能受到嚴重影響,由此導致的聽覺功能是不可逆性的損害。
　　 綜上所述,在AmAn耳毒性作用過程中,最初在外毛細胞的損害出現(xiàn)之前,AmAn可能直接作用于Prestin蛋白,影響其功能,也可能通過作用于Prestin蛋白的RNA合成階段,從而影響調(diào)控Prestin蛋白的表達及功能,最終導致聽覺功能的下降,產(chǎn)生

15、AmAn的急性耳毒性作用,這個過程是快速的,可逆的,如能夠及時去除AmAn的作用,聽覺功能會逐漸恢復;如果不能及時停止AmAn耳毒性作用,將導致外毛細胞凋亡、缺失,Prestin蛋白表達量嚴重減少,表達位置也發(fā)生改變,由此導致聽覺功能的永久性損害。這對于我們臨床預防和治療AmAn的耳毒性具有重要的參考價值。在臨床長期應用AmAn藥物時,應及時監(jiān)測患者的聽覺功能,并應注意對早期耳毒性先引起高頻聽覺(12kHz至16kHz)損害進行檢測,發(fā)

16、現(xiàn)聽覺功能早期損害時,應及時調(diào)整用藥,或是停藥一段時間,待聽覺功能恢復后再繼續(xù)治療。
　　 結論：
　　 1、在動物模型中,長期大劑量應用卡那霉素可以引起慢性耳毒性作用,聽覺功能損害隨著用藥時間的延長而加重,聽覺閾值升高,高頻聽覺功能較早受損。
　　 2、卡那霉素致小鼠耳毒性過程中,引起耳蝸內(nèi)細胞凋亡性死亡,且與用藥時間具有正相關性。
　　 3、在耳蝸內(nèi)細胞凋亡過程中,以Calpain(鈣調(diào)蛋白)信號轉導

17、途徑為主,Calpain蛋白表達上調(diào),且與用藥時間具有一定的正相關性。
　　 4、miR-34a參與了卡那霉素所致耳蝸內(nèi)細胞凋亡的調(diào)控,其表達量與用藥時間及細胞凋亡的嚴重程度呈正相關性。
　　 5、卡那霉素慢性耳毒性過程中,導致外毛細胞崩潰、死亡、缺失,引起Prestin蛋白的表達量減少,與用藥時間呈正相關性,Prestin蛋白的表達位置也發(fā)生改變;卡那霉素也可以直接地影響Prestin蛋白的RNA合成,隨著用藥時間的延

18、長,耳蝸Prestin蛋白的RNA含量逐漸減少,其改變明顯先于外毛細胞及prestin蛋白表達的形態(tài)學變化。
　　 6、在體外建立高表達Prestin蛋白的CHO-K1細胞株,研究顯示,卡那霉素與細胞外的氯離子濃度的改變都可以非特異性地影響細胞的膜電位,使細胞去極化;卡那霉素可以顯著性地升高轉染表達Prestin蛋白的細胞內(nèi)的氯離子濃度。細胞膜去極化及細胞內(nèi)的氯離子濃度的改變都會進一步影響到膜上表達的Prestin蛋白的功能。<