乙酰膽堿酯酶在細(xì)胞凋亡中的表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE，EC 3.1.1.7)是一種B型的羧酸酯酶，它在神經(jīng)膽堿能突觸部位和神經(jīng)肌肉接頭處迅速水解和滅活神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿。我們最近報(bào)道了在各種細(xì)胞類型的細(xì)胞系被誘導(dǎo)凋亡的過程中，AChE都會被誘導(dǎo)表達(dá)。但AChE被誘導(dǎo)表達(dá)的分子機(jī)制并不清楚。在本項(xiàng)研究中，我們首次表明了AChE在細(xì)胞凋亡中的表達(dá)受到細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控。在鈣離子通道A23187誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞和MDA-MB-43

2、5細(xì)胞凋亡中，AChE mRNA水平和蛋白水平的增加被一種細(xì)胞內(nèi)鈣離子拮抗劑BAPTA-AM明顯抑制。A23187能增加AChE mRNA的穩(wěn)定性并增加AChE啟動子的活性，而這兩種效應(yīng)也都能被BAPTA-AM所拮抗。Thapsigargin(TG)是另外一種能破壞細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡的誘導(dǎo)劑，在TG誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞和MDA-MB-435細(xì)胞凋亡中，它同樣能增加AChE的表達(dá)和AChE啟動子的活性，并且這兩種增加的效應(yīng)也都能被BAPTA-

3、AM所抑制。我們還首次闡明了A23187和TG對AChE啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用是部分通過人AChE啟動子上-1270到-1248序列中的一個順式作用元件CCAAT所介導(dǎo)的，而和這個順式作用元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子是CCAM結(jié)合因子(CBF/NF-Y)。EMSAs結(jié)果表明在A23187作用后，CBF/NF-Y和CCAAT順式作用元件的結(jié)合活力明顯下降。CCAAT位點(diǎn)的定點(diǎn)突變以及通過RNAi技術(shù)下調(diào)內(nèi)源CBF/NF-Y三元復(fù)合體中CBF-B/NF

4、-YA的表達(dá)都能明顯增加AChE啟動子的活性。這些結(jié)果表明當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物CBF/NF-Y結(jié)合在CCAAT順式作用元件上時存在一種抑制效應(yīng)，而在A23187誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，A23187對AChE啟動子的激活是部分由于CBF/NF-Y從CCAAT順式作用元件上解離，釋放出了這種抑制效應(yīng)，從而使AChE啟動子活力上升。 我們還進(jìn)一步探討了細(xì)胞凋亡中鈣離子對AChE的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)在A23187誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞和

5、MDA-MB-435細(xì)胞凋亡中， 一種鈣激活的半胱氨酸蛋白酶， 鈣蛋白酶(calpain)，和一種鈣依賴的蛋白磷酸酶，鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)，都調(diào)控了AChE的表達(dá)。Calpain的抑制劑calpeptin和calcineurin的抑制劑FK506以及cyclosporine A(CsA)都能抑制AChE mRNA和蛋白的表達(dá)，并且抑制AChE啟動子的活性。相反，過表達(dá)持續(xù)激活型的calcineurin能激活A(yù)ChE啟

6、動子。 另外我們還表明受calcineurin調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子家族NFAT(nuclear factor of actiVated T cells)在鈣離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中也調(diào)控了AChE啟動子的活性。在A23187誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中過表達(dá)人NFATc3和人NFATc4能明顯增加AChE啟動子的活性。 過表達(dá)核型的NFATc4能直接激活A(yù)ChE啟動子，而過表達(dá)負(fù)顯性失活的NFAT抑制了A23187對AChE啟動子的激活作用。