eRF3b和DRC3f抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化及其機(jī)制的體外研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)到在肝硬化、肝細(xì)胞肝癌、慢性肝炎患者血清中表達(dá)量不同的兩個(gè)小分子多肽:真核肽鏈釋放因子3b和脫精氨酸補(bǔ)體C3f。為了闡明eRF3b和DRC3f在慢性肝病發(fā)生和發(fā)展中的作用，本課題選擇二者對(duì)肝纖維化的影響作為切入點(diǎn)，通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，采用多肽片段合成和RNA干擾技術(shù)，在細(xì)胞和分子水平，研究二者對(duì)肝纖維化的影響，并進(jìn)一步探討相關(guān)的分子和信號(hào)機(jī)制。
　　本課題包括以下三

2、部分研究:
　　第一部分 eRF3b和DRC3f抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞纖維化因子的表達(dá)
　　目的:探討eRF3b和DRC3f對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC纖維化相關(guān)因子的表達(dá)的抑制作用
　　方法:①選用體外培養(yǎng)的人肝星狀細(xì)胞LX-2細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別用不同濃度TGF-β1、eRF3b和DRC3f刺激HSC，MTT法篩選TGF-β1適宜作用劑量和多肽最佳作用劑量。②將eRF3b和DRC3f氨基酸多肽，基因上調(diào)

3、質(zhì)粒表達(dá)載體pEGFP-C2-GSPT2、pEGFP-C2-GSPT-111，基因沉默質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6-GSPT2 shRNA干預(yù)TGF-β1刺激的HSC，RT-realtime PCR測(cè)定相關(guān)基因mRNA表達(dá);Westem blot測(cè)定相關(guān)基因蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.分別于24、48h，TGF-β1各濃度組的HSC增殖活力均高于對(duì)照組(P＜0.01)。于10ng/ml濃度達(dá)到增殖作用平臺(tái)期。
　　2.外

4、源性eRF3b氨基酸多肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC各因子表達(dá)的影響。
　　3.pEGFP-C2-GSPT2和pEGFP-C2-GSPT2-111對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC各因子表達(dá)的影響。
　　4.pGPU6-GSPT2 shRNA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC各因子表達(dá)的影響。
　　5.外源性DRC3f氨基酸多肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC各因子表達(dá)的影響。
　　結(jié)論:
　　1.TGF-β1可激活HSC，誘導(dǎo)H

5、SC產(chǎn)生ColⅠ、ColⅢ、CTGF、α-SMA等纖維化相關(guān)因子，成功構(gòu)建了TGF-β1激活HSC纖維性變模型。
　　2.在HSC內(nèi)TGF-β1的增加消耗GSPT2; eRF3b/DRC3f通過抑制TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)而發(fā)揮其作用。
　　3.外源性eRF3b氨基酸多肽、eRF3b基因上調(diào)、eRF3b基因沉默從多角度證明:eRF3b可通過TGF-β1通路抑制HSC ColⅠ、ColⅢ、CTGF、α-SMA的表達(dá)。

6、r>　　4.外源性DRC3f基酸多肽可通過TGF-β1通路抑制HSC ColⅠ、ColⅢ、CTGF、α-SMA的表達(dá)，但作用相對(duì)較弱。
　　第二部分 eRF3b和DRC3f對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖和細(xì)胞周期的影響
　　目的:探討eRF3b和DRC3f對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖和細(xì)胞周期的影響和機(jī)制
　　方法:分別用eRF3b和DRC3f氨基酸多肽，基因上調(diào)質(zhì)粒表達(dá)載體pEGFP-C2-GSPT2、pEGFP-

7、C2-GSPT-111，基因沉默質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6-GSPT2 shRNA干預(yù)TGF-β1激活的HSC，MTT法實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖活力，PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，RT-real time PCR測(cè)定相關(guān)因子mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.eRF3b氨基酸多肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖和細(xì)胞周期的影響。
　　2.pEGFP-C2-GSPT2和pEGFP-C2-GSPT2-111對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增

8、殖和細(xì)胞周期的影響。
　　3.GSPT2基因沉默對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖活力的影響。
　　4.DRC3f氨基酸多肽對(duì)HSC增殖和細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)論:①TGF-β1刺激HSC增殖作用最適宜作用濃度為10ng/ml。②eRF3b和DRC3f氨基酸多肽的最佳作用濃度均為100ng/ml。③eRF3b氨基酸多肽、eRF3b基因表達(dá)上調(diào)、基因沉默從多角度證明:eRF3b對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖有抑制作用;抑制

9、細(xì)胞周期S期，使細(xì)胞DNA合成阻滯在G0/G1期，其作用機(jī)制與Cyclin D1、CDK4、p21基因的調(diào)控有關(guān)。④DRC3f氨基酸多肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖有抑制作用;抑制細(xì)胞周期S期，使細(xì)胞DNA合成阻滯在G0/G1期，其作用機(jī)制基于對(duì)Cyclin D1、CDK4、p21基因表達(dá)的調(diào)控。⑤eRF3b和DRC3f抑制細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞周期S期和DNA合成可能是其抗纖維化的機(jī)制之一。
　　第三部分 eRF3b和DRC3f對(duì)

10、TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞凋亡和遷移的影響
　　目的:探討eRF3b和DRC3f對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC凋亡和遷移的影響及其機(jī)制。
　　方法:將eRF3b和DRC3f氨基酸多肽，基因上調(diào)質(zhì)粒表達(dá)載體pEGFP-C2-GSPT2、pEGFP-C2-GSPT-111，基因沉默質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6-GSPT2 shRNA干預(yù)TGF-β1刺激的HSC，PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSC的遷移能力，RT-rea

11、l time PCR測(cè)定相關(guān)基因mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.外源性eRF3b氨基酸多肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC凋亡和遷移的影響。
　　2.pEGFP-C2-GSPT2和pEGFP-C2-GSPT2-111對(duì)HSC凋亡和遷移的影響。
　　3.pGPU6-GSPT2 shRNA對(duì)HSC凋亡和遷移的影響。
　　(1)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的HSC凋亡率分別為:1.66％，13.35％，5.53％，TGF組和TGF+

12、pGPU6-GSPT2 shRNA組細(xì)胞凋亡率比對(duì)照組顯著增多(P＜0.001)，TGF+pGPU6-GSPT2 shRNA組比TGF組進(jìn)一步升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.096)。
　　(2) TGF、pGPU6-GSPT2 shRNA組Bcl-2的表達(dá)量TGF組比對(duì)照組表達(dá)減少(P=0.008)，TGF+pGPU6-GSPT2 shRNA組比TGF組數(shù)值上減少(P=0.650)。3組Bax和Fas的表達(dá)量TGF組比對(duì)照組升高(

13、P=0.005，0.001)，pGPU6-GSPT2 shRNA組比TGF組數(shù)值上進(jìn)一步升高(P=0.002，0.766)。
　　(3)于24、48h，TGF組同等時(shí)間內(nèi)較對(duì)照組相對(duì)遷移距離大(P=0.001，＜0.001)，TGF+ pGPU6-GSPT2 shRNA組較TGF組進(jìn)一步增加(P=0.002，0.222)。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量TGF組比對(duì)照組表達(dá)升高(P＜0.001)，TGF+pGPU6-GS

14、PT2 shRNA組比TGF組進(jìn)一步升高(P=0.009)。
　　4.外源性DRC3f氨基酸多肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC凋亡和遷移的影響
　　(1)于24、48h，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的HSC凋亡率分別為:0.56％，4.66％，0.91％;1.66％，13.35％，3.08％，TGF組細(xì)胞凋亡率比對(duì)照組顯著增多(P＜0.001)，DRC3f組比TGF組減少(P＜0.001)。
　　(2)3組Bcl-2的表達(dá)量，僅數(shù)值上TGF

15、組較對(duì)照組表達(dá)減少(P=0.208)，TGF+DRC3f組較TGF組增加(P=0.204)。Bax和Fas的表達(dá)量TGF組比對(duì)照組表達(dá)升高(P=0.018，0.004)，TGF+DRC3f組比TGF組僅數(shù)值上降低(P=0.150，0.653)。
　　(3)2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TGF組同等時(shí)間內(nèi)較對(duì)照組相對(duì)遷移距離增大(P=0.002)，TGF+DRC3f組較TGF組減小(P=0.146，0.023)。TGF組和TGF+eRF3b組α-SM

16、A mRNA表達(dá)量TGF組比對(duì)照組升高(P＜0.001)，TGF+ DRC3f組比TGF組降低(P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.eRF3b氨基酸肽、eRF3b基因上調(diào)、eRF3b基因沉默從多角度證明:eRF3b對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC凋亡有抑制作用。其機(jī)制可能與調(diào)控Bax、Fas、Bcl-2基因的表達(dá)有關(guān)。
　　2.從多角度證明:eRF3b對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC遷移有抑制作用。其作用機(jī)制可能與抑制HSC細(xì)