重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子凝膠對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的實驗研究.pdf

1、目的:通過建立大鼠深Ⅱ度燙傷模型,觀察外用重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)凝膠與外用碘伏紗布包扎治療對實驗性深Ⅱ度燙傷動物的療效比較,探討重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子凝膠對深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的影響及促進創(chuàng)面愈合的作用機制。
　　方法:
　　1.模型制作:將40只SD大鼠隨機分為實驗組和對照組,每組為20只,平均體重在(250±25)g,雌雄不限。將SD大鼠稱重后以0.3％戊巴比妥鈉(1ml/100g)

2、腹腔注射麻醉,麻醉起效后于背部用6％硫化鈉脫毛。24h后以0.3％戊巴比妥鈉(1ml/100g)腹腔注射麻醉。所有大鼠均采用同樣的燙傷條件。選用一塊大小為22cm×11cm的木板,中間制作一個5cm×6cm的長方形孔,將大鼠取仰臥位四肢固定于木板上,使其背部脫毛區(qū)皮膚暴露于木板孔內(nèi),然后將木板置于熱水溫度為80℃的電熱恒溫水浴鍋上,輕度按壓木板使背部脫毛區(qū)皮膚浸泡在熱水里,按壓15s后迅速將木板離開水面即造成大鼠背部深I(lǐng)I度燙傷,深度經(jīng)

3、組織學證實。燙傷后用干紗布揩干受傷區(qū),在腹腔內(nèi)注射5ml0.9％生理鹽水進行復蘇。實驗組將重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子凝膠均勻涂抹于創(chuàng)面上,厚度約1mm,先用一層凡士林紗布覆蓋,再用3-4層無菌紗布包扎,紗布外用膠布纏繞固定;對照組先將0.5％強力碘溶液用0.9％生理鹽水稀釋10倍配成0.5％碘溶液,然后將浸有0.5％碘溶液的紗布覆蓋創(chuàng)面,外用3-4層無菌紗布包扎,紗布外用膠布纏繞固定。每天給藥1次,連續(xù)用藥13天;分別在給藥后第

4、4天、7天、10天、13天,每組隨機選取5只SD大鼠處死。
　　2.創(chuàng)面大體觀察:每天下午16時觀察并記錄實驗組創(chuàng)面與對照組創(chuàng)面的痂殼形成與脫落情況、分泌物的情況以及創(chuàng)緣反應等。
　　3.創(chuàng)面愈合率(WHR)計算:在用藥前用透明方格紙描出所有SD大鼠燙傷創(chuàng)面的圖形并計算出該圖形的面積,即為用藥前的創(chuàng)面面積;在給藥后第4天、7天、10天、13天,用透明方格紙描出每組被隨機選取的5只SD大鼠處死后的創(chuàng)面圖形并計算出該圖形的面積,

5、即為用藥后的創(chuàng)面面積,并將用藥前創(chuàng)面的面積減去用藥后創(chuàng)面的面積比用藥前創(chuàng)面的面積,即創(chuàng)面愈合率(wound healing rate,WHR)。
　　4.成纖維細胞(FB)計數(shù):在給藥后第4天、7天、10天、13天,實驗組和對照組各隨機選取5只SD大鼠處死,在創(chuàng)面中央進行創(chuàng)面取材,將燙傷創(chuàng)面皮膚全層完整取出后置于4％多聚甲醛液中固定。24h后,將試驗所取組織進行逐級酒精脫水(75％→85％→95％→100％),用二甲苯將脫水后標本

6、透明兩次,石蠟包埋、切片,并行HE染色,在光鏡下觀察實驗所取組織,隨機法取5個視野,于400倍鏡下觀察,計數(shù)成纖維細胞,取其平均值。
　　5.創(chuàng)面微血管密度(MVD):以抗血管Ⅷ因子抗體對標本進行免疫組織化學染色,對實驗組和對照組在燙傷后第4天、7天、10天、13天的實驗所取組織的病理切片進行顯微鏡下觀察并選取5個連續(xù)而不重疊的視野進行微血管計數(shù),對比各組切片中微血管數(shù)量的差異。
　　6.創(chuàng)面膠原纖維的陽性面積計算:對實驗組

7、和對照組實驗所取組織標本進行 Masson三色膠原染色,在光鏡下觀察燙傷后第4天、7天、10天、13天創(chuàng)面中膠原的含量,并在創(chuàng)面中心隨機法取5個視野,與400倍鏡下用Image-Pro Plus圖像分析軟件,測定膠原纖維的陽性面積。
　　結(jié)果:
　　1.創(chuàng)面大體觀察:實驗組創(chuàng)面和對照組創(chuàng)面經(jīng)兩種不同治療方法處理后,兩組的燙傷創(chuàng)面均隨時間延長而逐漸縮小,其中實驗組創(chuàng)面結(jié)痂速度、脫痂速度較對照組快,對照組創(chuàng)面分泌物相對較多,部分

8、呈膿性分泌物;對照組創(chuàng)緣紅、腫等創(chuàng)緣反應持續(xù)時間明顯較實驗組長。
　　2.創(chuàng)面愈合率:實驗組和對照組燙傷創(chuàng)面面積均隨時間延長而逐漸縮小。在大鼠燙傷后第4天的創(chuàng)面愈合率均呈輕度增長,實驗組和對照組分別為:5.39±0.45和4.92±0.69,兩者比較差異性無統(tǒng)計學意義(P>0.05),;在燙傷后第7天、10天、13天,實驗組創(chuàng)面愈合率分別為:17.54±1.49、27.67±1.00、52.40±4.84;而對照組創(chuàng)面愈合率分別為

9、:11.48±0.80、15.59±0.50、31.91±2.67,兩者比較差異性有統(tǒng)計學意義(P<0.05),實驗組的創(chuàng)面愈合率較對照組高。
　　3.成纖維細胞含量:實驗組和對照組創(chuàng)面所取組織標本的病理切片經(jīng)HE染色后,在光學顯微鏡下觀察,燙傷后第4天,實驗組和對照組實驗所取組織創(chuàng)緣均有少許表皮細胞生長,周圍有成纖維細胞及炎性細胞浸潤,實驗組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);在燙傷后第7天、10天,實驗組創(chuàng)面創(chuàng)緣的

10、上皮增殖情況較對照組更明顯,且創(chuàng)面中心的成纖維細胞含量及毛細血管數(shù)目亦更多,兩組創(chuàng)面成纖維細胞含量相比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);燙傷后第13天時,實驗組和對照組的成纖維細胞含量均較之前多,但實驗組中創(chuàng)面中心的成纖維細胞含量少于對照組,兩者相比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　4.創(chuàng)面微血管密度(MVD):將實驗組和對照組燙傷后第4天、7天、10天、13天創(chuàng)面所取組織標本的病理切片經(jīng)免疫組織化學染色后,進行顯微

11、鏡下觀察并選取5個連續(xù)而不重疊的視野進行微血管計數(shù),取其平均值作為該標本的微血管數(shù)值。實驗組在燙傷后第4天、7天、10天、13天的微血管計數(shù)分別為:1.623±0.272、2.358±0.135、5.557±0.479、7.807±0.242;對照組在燙傷后第4天、7天、10天、13天的微血管計數(shù)分別為:0.856±0.109、1.497±0.282、3.446±0.286、6.002±0.313,兩組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0

12、5)。
　　5.創(chuàng)面膠原含量:將實驗組和對照組燙傷后第4天、7天、10天、13天創(chuàng)面所取組織標本的病理切片經(jīng)Masson染色后,在400倍鏡下觀察。燙傷后第4天,實驗組和對照組創(chuàng)面所取組織中均有少量膠原纖維,實驗組多于對照組(P<0.05);燙傷后第7天、10天、13天,實驗組和對照組創(chuàng)面中新生膠原纖維均隨時間延長逐漸增多,實驗結(jié)果顯示,實驗組創(chuàng)面在燙傷后第7天、10天、13天的膠原含量始終高于對照組(P<0.05)。實驗組創(chuàng)面中