電針對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨MMP-9及TIMP-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的慢性退行性疾病,其病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,是力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用引起關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)以及軟骨下骨三者合成與降解的正常偶聯(lián)失去原有平衡的結(jié)果。其中,引起OA關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性變的一個(gè)重要原因在于關(guān)節(jié)軟骨ECM合成與降解之間的內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs

2、)是參與關(guān)節(jié)軟骨ECM和基底膜降解過(guò)程的所有酶中最重要的一種,其發(fā)揮酶類作用的特異性抑制物是金屬蛋白酶組織抑制劑(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMPs),ECM內(nèi)環(huán)境維持主要依賴于MMPs/TIMPs的動(dòng)態(tài)平衡,二者在OA軟骨發(fā)生退行性變過(guò)程中都起著非常重要的作用。電針通過(guò)毫針刺激將低頻脈沖微電流傳入相應(yīng)穴位,使皮膚、肌肉、關(guān)節(jié)囊、韌帶等本體感受器受到刺激后使大量的本體運(yùn)動(dòng)和皮膚感覺(jué)的信息傳入

3、中樞,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)肌張力、緩解痙攣、通絡(luò)止痛等作用,是一種對(duì)早、中期OA有效的非藥物治療方法,但目前仍以臨床研究為主,機(jī)制方面的研究甚少。本課題通過(guò)HE染色、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)電針治療前后兔膝骨關(guān)節(jié)炎(kneeosteoarthritis,KOA)關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)、軟骨細(xì)胞病理改變情況以及軟骨組織中MMP-9和TIMP-1表達(dá)含量的變化進(jìn)行觀測(cè),探討電針在細(xì)胞、分子水平上治療KOA的作用機(jī)制,為今后的實(shí)驗(yàn)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),也為臨床工

4、作提供一定的理論依據(jù)。
　　方法:(1)對(duì)象和干預(yù)措施:選取健康新西蘭大耳兔30只,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為三組,即正常組、模型組和電針干預(yù)組。正常組常規(guī)喂養(yǎng)不實(shí)施任何干預(yù)措施,其余兩組兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行伸直位管型石膏固定,構(gòu)建OA模型。喂養(yǎng)6周后,用5ml空針向兔耳緣靜脈注入適量空氣處死正常組與模型組,切開(kāi)暴露左側(cè)膝關(guān)節(jié),取內(nèi)側(cè)髁軟骨,對(duì)造模后的相關(guān)指標(biāo)變化情況進(jìn)行觀察。同時(shí),電針干預(yù)組取造模關(guān)節(jié)附近“梁丘”、“足三里”、“血?！?、“

5、陽(yáng)陵泉”四個(gè)臨床常用穴位,用30號(hào)一寸毫針針刺,接著將G9805-C型低頻電子脈沖治療儀與針柄相連,調(diào)至疏、密波交替模式,頻率分別選擇4Hz、20Hz,脈沖寬度0.5ms,20min/次,1次/日,干預(yù)10次后用與模型組相同的方法處死電針干預(yù)組,取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髁軟骨觀測(cè)其各方面的變化情況。(2)觀察指標(biāo):①三組兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)均通過(guò)肉眼大體觀察形態(tài)改變情況;②切取左膝股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨,置于40g/L多聚甲醛固定液內(nèi),10％EDTA脫鈣液脫鈣

6、后,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色,光鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)、潮線完整性等,按彭太平組織病理結(jié)構(gòu)分級(jí)和Mankin’s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)觀察結(jié)果進(jìn)行分級(jí)、評(píng)分。③免疫組織化學(xué)檢測(cè):用兔抗MMP-9及TIMP-1試劑分別進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),測(cè)二者在正常組、模型組和電針干預(yù)組兔左膝股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨的表達(dá)情況。(3)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SPSS15.0軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

7、結(jié)果:(1)軟骨結(jié)構(gòu)大體觀察:正常組兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)無(wú)明顯關(guān)節(jié)積液,通過(guò)大體觀察發(fā)現(xiàn)軟骨表面平整,呈藍(lán)白色且泛亮光,無(wú)裂紋,關(guān)節(jié)面及滑膜為I級(jí),軟骨結(jié)構(gòu)Mankin’s評(píng)分為0分。模型組經(jīng)伸直位管型石膏固定6周后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)幾乎均可見(jiàn)有積液,關(guān)節(jié)面不光滑且略欠平整,少數(shù)部位可見(jiàn)糜爛,外觀均較灰暗,顏色偏黃,光澤度較正常組差,關(guān)節(jié)面及滑膜為III級(jí);電針干預(yù)組部分造模關(guān)節(jié)可見(jiàn)關(guān)節(jié)腔積液,滑膜增生,光澤度與正常組相比仍有差異,未見(jiàn)明顯糜爛,軟骨表

8、面不光滑,欠平整,與模型組相比已有所改善;根據(jù)Mankin’s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)比較模型組及電針干預(yù)組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)HE染色病理學(xué)觀察:正常組兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨表面平整,軟骨層厚度基本一致,軟骨細(xì)胞大小接近,排列規(guī)則,深層細(xì)胞、中間層細(xì)胞、表層細(xì)胞分別呈柱形、圓形、梭形,中間層分布較散,表層接近平行排列,潮線完整,Mankin’s評(píng)分記為0分;模型組染色結(jié)果顯示軟骨表層有小裂隙,軟骨層厚度與正常組相比明顯變薄

9、,軟骨細(xì)胞數(shù)量下降,細(xì)胞排列無(wú)規(guī)則,局部呈現(xiàn)大量簇聚,潮線紊亂,Mankin’s評(píng)分較正常組增加(P<0.05),電針干預(yù)組軟骨表面較規(guī)則,裂隙少,成簇少見(jiàn),軟骨細(xì)胞排列整齊,Mankin’s評(píng)分較模型組減小(P<0.05),但與正常組比較,軟骨細(xì)胞數(shù)較模型組明顯增多,軟骨層厚度較模型組增加,可見(jiàn)潮線紊亂,Mankin’s評(píng)分增加(P<0.05)。(3)免疫組化MMP-9及TIMP-1測(cè)定:正常組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞漿中偶見(jiàn)淺棕黃色MMP-9

10、及TIMP-1弱陽(yáng)性染色;模型組大量軟骨細(xì)胞中可見(jiàn)棕色MMP-9強(qiáng)陽(yáng)性染色顆粒,尤以深層密度最高,成熟軟骨細(xì)胞中較多,為深棕褐色顆粒,少量細(xì)胞可見(jiàn)棕黃色TIMP-1陽(yáng)性染色;電針干預(yù)組部分軟骨細(xì)胞中可見(jiàn)棕黃色MMP-9陽(yáng)性染色,以及大量深棕色TIMP-1強(qiáng)陽(yáng)性染色顆粒。電針干預(yù)組MMP-9表達(dá)量較模型組減少,與正常組比表達(dá)量增加(P<0.05),電針干預(yù)組TIMP-1表達(dá)量較模型組增加,與正常組比呈高表達(dá)(P<0.05)。
　　結(jié)

11、論:(1)本實(shí)驗(yàn)采用石膏對(duì)兔膝關(guān)節(jié)進(jìn)行伸直位機(jī)械性制動(dòng)6周可成功復(fù)制OA模型。(2)MMP-9與TIMP-1的基礎(chǔ)分泌量對(duì)維持關(guān)節(jié)軟骨的完整性至關(guān)重要,如果MMP-9/TIMP-1二者之間失衡會(huì)造成與關(guān)節(jié)軟骨相應(yīng)的ECM過(guò)度降解,從而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨退變。(3)電針能減緩?fù)肒OA關(guān)節(jié)軟骨退變,促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù),其作用機(jī)制可能與減少軟骨中MMP-9含量、增加TIMP-1含量有關(guān),有效調(diào)整了MMPs/TIMPs二者的平衡,抑制了ECM的