NOD2在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的作用及機制研究.pdf

1、背景:
　　糖尿病腎病是嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的最常見原因，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因。雖然傳統(tǒng)意義上認(rèn)為糖尿病腎病是一種非免疫系統(tǒng)疾病，但是越來越多的臨床和動物實驗研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病中存在大量浸潤的免疫細(xì)胞、炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子，細(xì)胞外基質(zhì)，并與腎臟固有細(xì)胞損傷相互關(guān)聯(lián)，這表明固有免疫系統(tǒng)的激活和炎癥機制在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　固有免疫是機體抵抗外來致病因子入侵的第一道防線。主要通

2、過模式識別受體(patternrecognitionreceptors，PRR)識別進(jìn)化上高度保守的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMP)或者損傷相關(guān)分子模式(damage-associatedmolecularpatterns，DAMP)，誘發(fā)組織處于持續(xù)炎性損傷狀態(tài)。目前模式識別受體中的細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-bindingoligomeri

3、zationdomain，NOD)蛋白家族，NOD樣受體(NOD-likereceptors，NLR)，是當(dāng)前研究的熱點，其中對NOD2的研究較多。NOD2包含2個CARD結(jié)構(gòu)域，識別肽聚糖中的胞壁酰二肽(MDP)，在炎癥穩(wěn)態(tài)中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)NOD2突變基因與克羅恩病和Blau綜合征的易感性有關(guān)，這使NOD2在炎癥穩(wěn)態(tài)中的重要作用突顯了出來。NOD2不僅分布在炎癥細(xì)胞中，還廣泛存在于其他細(xì)胞，例如脂肪細(xì)胞和上皮細(xì)胞等。病理條件下，

4、NOD2在激活這些細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的過程中起重要作用。
　　胰島素抵抗(IR)貫穿二型糖尿病的整個發(fā)病過程，能夠?qū)е聶C體高血糖反應(yīng)，長期高血糖引發(fā)的固有免疫和炎癥反應(yīng)能夠進(jìn)一步加重組織的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。有研究表明胰島素抵抗與固有免疫系統(tǒng)的激活以及慢性低程度的炎癥反應(yīng)有關(guān)。足細(xì)胞作為腎小球濾過膜的主要組成部分，也是胰島素敏感細(xì)胞，且蛋白尿的生成與胰島素抵抗導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷有關(guān)。足細(xì)胞可以依賴于細(xì)胞骨架微絲蛋白易化葡萄糖轉(zhuǎn)運子GLUT1

5、和GLUT4，同時依賴足細(xì)胞特異蛋白腎病蛋白(nephrin)可以促使富含GLUT1和GLUT4的微泡與細(xì)胞膜融合。因而，nephrin在足細(xì)胞胰島素敏感性上起著至關(guān)重要的作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)NOD2在人和小鼠的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，Nod2敲除可以改善腎缺血再灌注引起的損傷，但有關(guān)NOD2在腎臟其他細(xì)胞中的表達(dá)分布以及是否在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用，迄今尚未見報道。
　　目的:
　　一、確定NOD2在糖尿病腎病活檢樣本

6、和動物模型中的表達(dá)情況，并明確NOD2是否與糖尿病腎病的炎癥病理過程有關(guān)。
　　二、從炎性反應(yīng)與足細(xì)胞的胰島素抵抗角度深入探討NOD2參與糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的作用及機制。
　　方法:
　　動物學(xué)研究
　　實驗采用選用8周野生型C57BL/6J小鼠和NOD2-/-小鼠各20只隨機分成四組，即野生型正常飲食組，野生型高脂飲食/STZ刺激組，NOD2-/-小鼠正常飲食組和NOD2-/-小鼠高脂飲食/STZ刺激組(n

7、ormal-dietwild-typemice，HFD/STZ-inducedwild-typemice,normal-dietNOD2-/-mice,HFD/STZ-inducedNOD2-/-mice）。正常組給以正常飲食，高脂飲食/STZ刺激組給予持續(xù)高脂飲食14周和STZ刺激以制備糖尿病小鼠模型。通過采用PAS染色和電鏡分析兩種辦法，觀察各組腎小球病理改變變化。Westernblot檢測NOD2在野生小鼠各器官中的表達(dá)以及野生糖

8、尿病小鼠腎臟皮質(zhì)NOD2表達(dá)變化。連續(xù)切片免疫組化染色檢測糖尿病小鼠腎臟NOD2表達(dá)變化和浸潤的單核巨噬細(xì)胞表達(dá)NOD2的情況。進(jìn)行Elisa和實時定量RT-PCR方法檢測炎癥因子表達(dá)。通過組織免疫熒光染色和Westernblot兩種方法檢測各組腎小球nephrin表達(dá)變化。
　　相關(guān)疾病病人樣本研究
　　獲取正常人、糖尿病腎病病人、糖尿病非腎病病人、局灶性節(jié)段性腎小球硬化病人、IgA膜性腎病病人、膜性腎小球腎炎病人、紅斑狼

9、瘡腎炎病人、腎微小病變病人活檢樣本。進(jìn)行免疫組化染色確定糖尿病腎病樣本NOD2表達(dá)變化和浸潤的巨噬細(xì)胞NOD2的表達(dá)情況。實時定量RT-PCR檢測NOD2mRNA含量，判斷NOD2mRNA與估算腎小球濾過率和24小時尿蛋白量的關(guān)系。
　　體外實驗研究
　　體外培養(yǎng)腎臟固有細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR檢測腎臟固有細(xì)胞NOD2mRNA的表達(dá)。體外模擬糖尿病腎病病理狀態(tài)，Westemblot檢測足細(xì)胞在高糖、糖基化終末產(chǎn)物(AGE)、腫

10、瘤刺激因子-α(TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β，糖尿病腎病常見損傷因子）刺激下NOD2的表達(dá)變化。MDP激活足細(xì)胞NOD2后，Westernblot檢測phospho-ERK1/2、phospho-p38、phospho-JNK、IκBα的變化評估MAPKs通路和NF-κB通路激活情況;實時定量RT-PCR檢測促炎因子的變化;流式細(xì)胞術(shù)測足細(xì)胞的凋亡;MDP刺激足細(xì)胞，葡萄糖攝取實驗評估足細(xì)胞對葡萄糖的攝取情況;細(xì)胞免疫熒光

11、觀察GLUT4在胞膜的分布變化;Westernblot檢測GLUT4在細(xì)胞膜的表達(dá)變化;通過Westernblot檢測MDP激活NOD2誘導(dǎo)胰島素受體底物-1絲氨酸殘基的磷酸化，免疫共沉淀法評估MDP影響胰島素誘導(dǎo)的胰島素受體底物-1酪氨酸殘基與p85亞基的結(jié)合從而判斷胰島素信號通路的變化情況。通過Westernblot檢測高糖和MDP刺激對足細(xì)胞nephrin表達(dá)情況的影響;通過shRNA干擾技術(shù)檢測Nod2基因沉默對高糖條件下足細(xì)胞

12、nephrin表達(dá)情況的影響。
　　結(jié)果:
　　NOD2在腎臟細(xì)胞的表達(dá)
　　本課題首先檢測NOD2在腎臟組織和腎臟細(xì)胞中的表達(dá)。與成年小鼠小腸組織、脾臟、肺臟相比較，腎臟的表達(dá)量較高。這與以往研究NOD2器官特異性表達(dá)的結(jié)果相一致。NOD2在野生型和NOD2-/-小鼠腎臟和小腸石蠟切片的免疫組化染色進(jìn)一步顯示了NOD2的表達(dá)模式以及NOD2抗體免疫組化染色的特異性。小鼠腎小球系膜細(xì)胞、小鼠足細(xì)胞、人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞以及

13、人遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞均表達(dá)NOD2。
　　人糖尿病腎病活檢樣本和HFD/STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的腎皮質(zhì)NOD2的表達(dá)升高
　　人糖尿病腎病活檢樣本石蠟切片的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)NOD2表達(dá)上調(diào)。針對CD68和NOD2的連續(xù)切片染色可以在間質(zhì)和腎小球中觀察到CD68陽性的單核巨噬細(xì)胞浸潤，并且與NOD2共定位，這說明NOD2在腎臟固有細(xì)胞和浸潤的免疫細(xì)胞中表達(dá)增強共同導(dǎo)致了腎臟中NOD2的表達(dá)上調(diào)。實時定量RT-PCR分析進(jìn)一步證

14、實糖尿病腎病活檢樣本NOD2mRNA水平升高。同時，本課題也檢測了NOD2在其他類型的腎臟疾病中的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，除腎微小病變病人(n=8)外，局灶性節(jié)段性腎小球硬化病人(n=7)、IgA膜性腎病病人(n=7)、膜性腎小球腎炎病人(n=6)和紅斑狼瘡腎炎病人(n=9)的腎活檢樣本的NOD2mRNA水平明顯升高。所有樣本中NOD2mRNA水平與估算腎小球濾過率成負(fù)相關(guān)（Spearman'sr=-0.7274，P＜0.01）。在有

15、蛋白尿的樣本中，NOD2mRNA水平與蛋白尿無明顯相關(guān)性（Spearman'sr=-0.1384，P＞0.05）。
　　HFD/STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，HFD/STZ誘導(dǎo)產(chǎn)生高血脂，增加血漿甘油三酯和游離脂肪酸含量，而血壓無明顯變化。Westernblot和免疫組化分析發(fā)現(xiàn)HFD/STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠模型中腎NOD2的水平明顯升高，而且浸潤的炎癥細(xì)胞也同樣導(dǎo)致了腎臟NOD2的升高，這與糖尿病腎病病人的檢測結(jié)果是

16、一致的。
　　NOD2缺失減輕糖尿病腎病小鼠腎臟損傷
　　與野生型糖尿病腎病小鼠相比，NOD2-/-的糖尿病腎病小鼠的蛋白尿明顯減少，同時伴隨系膜細(xì)胞增生和足細(xì)胞損傷減輕。進(jìn)一步實驗表明，NOD2-/-糖尿病腎病小鼠雙腎和血清的促炎細(xì)胞因子和趨化因子水平減低，包括IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)以及細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1)。糖尿病腎病小鼠腎臟組織中腎臟纖維化相關(guān)分子包括

17、膠原Ⅳ和纖連蛋白的水平也降低。
　　高糖環(huán)境各因子刺激足細(xì)胞NOD2表達(dá)上調(diào)
　　足細(xì)胞NOD2表達(dá)上調(diào)具有葡萄糖濃度依賴性，其中甘露醇對照組NOD2的表達(dá)沒有明顯變化，說明可以排除滲透壓對NOD2的影響。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞在糖基化終末產(chǎn)物、TNF-α和TGF-β的刺激下，NOD2的表達(dá)均顯著升高并呈濃度依賴性。
　　MDP誘導(dǎo)MAPK信號通路激活、促炎遞質(zhì)的生成和足細(xì)胞凋亡
　　MDP刺激足細(xì)胞激活NOD2，

18、檢測發(fā)現(xiàn)特異性細(xì)胞外液信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、p38MAPK和c-JunN-端激酶(JNK)磷酸化水平升高，且MDP以時間依賴的方式調(diào)控NF-κB信號通路的關(guān)鍵成分IκBα的降解。同時，MDP增加足細(xì)胞促炎遞質(zhì)的生成，進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)MDP誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。NOD2介導(dǎo)足細(xì)胞的葡萄糖吸收、GLUT4轉(zhuǎn)位和胰島素信號通路
　　在胰島素刺激下，足細(xì)胞葡萄糖攝取明顯增加，而MDP可以選擇性的減低胰島素誘導(dǎo)的2-脫氧葡萄糖

19、的吸收。進(jìn)而免疫熒光染色和Westernblot證明MDP破壞胰島素誘導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，這與NOD2激活減少胰島素誘導(dǎo)的足細(xì)胞葡萄糖吸收的實驗結(jié)果相一致。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)NOD2的激活引起IRS-1絲氨酸殘基的磷酸化，胰島素刺激后IRS-1酪氨酸殘基的磷酸化水平減輕。同時通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，MDP降低胰島素刺激引起的p85亞基與磷酸化的IRS酪氨酸殘基之間的相互結(jié)合，影響下游PI3K通路。
　　高血糖時NOD2的激活降低n

20、ephrin的表達(dá)
　　免疫熒光分析和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，在正常飲食小鼠nephrin染色沿著腎小球血管袢呈現(xiàn)流暢線型，但在糖尿病腎病小鼠nephrin明顯減少，在NOD2-/-糖尿病腎病小鼠又有所改善。在體外實驗研究中，高糖降低足細(xì)胞nephrin的表達(dá)，而MDP也降低足細(xì)胞nephrin的表達(dá)。更重要的是，本課題發(fā)現(xiàn)MDP引起足細(xì)胞actin微絲減少且胞漿actin呈顆粒狀分布說明MDP降低nephrin的表達(dá)與細(xì)

21、胞骨架蛋白的改變相關(guān)。進(jìn)一步通過shRNA-NOD2轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)，Nod2沉默可以使高糖誘導(dǎo)的nephrin表達(dá)降低的程度減輕。
　　結(jié)論:
　　1.首次明確NOD2在人糖尿病腎病腎組織及糖尿病腎病小鼠模型中的表達(dá)上調(diào)。而NOD2-/-糖尿病小鼠的腎小球改變明顯減輕，蛋白尿情況得到改善，炎癥介質(zhì)的生成減少，提示NOD2在糖尿病腎病中可能發(fā)揮重要作用。
　　2.NOD2在腎臟疾病中均表達(dá)升高且NOD2水平與腎小球率過濾之間

22、存在負(fù)相關(guān)，與蛋白尿之間不存在明顯的相關(guān)關(guān)系，提示NOD2的表達(dá)上調(diào)很可能是人類炎癥相關(guān)腎臟疾病的共同特征。
　　3.糖尿病腎病病人和小鼠糖尿病動物模型腎臟組織連續(xù)切片中NOD2與單核巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD68共定位，表明NOD2在腎臟固有細(xì)胞和浸潤的免疫細(xì)胞中表達(dá)增強共同導(dǎo)致了腎臟中NOD2的表達(dá)上調(diào)。
　　4.足細(xì)胞中NOD2表達(dá)增高呈現(xiàn)葡萄糖濃度依賴性，同時伴隨促炎因子的增多和MAPKs及NF-κB信號通路的激活;NOD