Sirt6在糖尿病腎病足細胞損傷中的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　1.探究SIRTs家族各成員在糖尿病腎病中的表達模式，明確Sirt1-7各亞型是否參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展以及足細胞的損傷。
　　2.闡明Sirt6在糖尿病腎病足細胞損傷中的作用。
　　3.探討Sirt6改善糖尿病腎病足細胞損傷的作用機制。
　　方法：
　　第一部分:SIRTs家族各成員在糖尿病腎病中的表達模式
　　1.1 在糖尿病腎病小鼠腎臟皮質(zhì)中檢測SIRTs家族各成員的表達變化:<

2、br>　　通過單腎切除后腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）構(gòu)建糖尿病腎病小鼠模型模型。利用蛋白免疫印跡(Western blot，WB)檢測Sirt1-7在糖尿病腎病小鼠腎臟皮質(zhì)中蛋白表達變化。
　　1.2 利用臨床標本探究Sirt6在足細胞損傷相關(guān)腎病病人腎活檢標本中的蛋白表達情況及其與腎小球率過濾(glomerular filtration rate，GFR)、蛋白尿的相關(guān)性分析。
　　1.3 在體外

3、培養(yǎng)的人源足細胞(human podocyte，HPC)中檢測不同刺激下Sirt6的蛋白表達變化:
　　體外培養(yǎng)人源足細胞，分別給予高糖（high glucose，HG）和糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGE)刺激24小時后，抽提細胞內(nèi)蛋白，進行蛋白免疫印跡分析，檢測在不同刺激下Sirt6在HPC中的蛋白表達變化。
　　第二部分:Sirt6在糖尿病腎病足細胞損傷中的作用

4、>　　2.1 足細胞特異性敲除Srit6的小鼠的構(gòu)建及表型觀察:
　　利用Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建足細胞特異性敲除Srit6的小鼠，通過鼠尾DNA提取后的基因型鑒定確證特異性敲除小鼠的構(gòu)建成功;接下來利用免疫熒光雙標法進一步觀察敲除小鼠腎臟石蠟切片中足細胞內(nèi)Sirt6的蛋白表達水平;另外，利用腎小球分離技術(shù)對敲除小鼠進行腎小球分離，然后采用蛋白免疫印跡檢測腎小球內(nèi)Sirt6的蛋白表達水平，進一步在蛋白水平上對Sirt6敲除效率進行

5、評價。
　　2.2 敲除足細胞Sirt6對糖尿病腎病小鼠足細胞以及蛋白尿的影響:
　　首先取小鼠血清及尿液進行分析，比較糖尿病腎病基因敲除小鼠與野生型小鼠蛋白尿水平的差異。利用過碘酸雪夫氏染色觀察不同處理組基因敲除小鼠與野生型小鼠腎小球形態(tài)學差異。利用電子顯微鏡對不同處理組基因敲除小鼠與野生型小鼠足細胞形態(tài)進行觀察。
　　2.3 體外研究Sirt6對高糖(HG)刺激下的足細胞的保護作用:
　　體外研究中，利用Si

6、rt6腺病毒轉(zhuǎn)染HPC，實現(xiàn)HPC內(nèi)Sirt6蛋白高表達。首先通過熒光實時定量RT-PCR檢測在HG刺激下，過表達Sirt6對HPC中炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6和TNFαmRNA水平的影響。
　　第三部分:Sirt6改善糖尿病腎病足細胞損傷的作用機制
　　3.1 檢測足細胞內(nèi)Sirt6對H3K9位點的乙?；降恼{(diào)控:
　　免疫組化方法觀察糖尿病腎病病人以及局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥病人的腎活檢標本中H3K9乙?；?/p>

7、水平的變化。免疫熒光雙標實驗繼續(xù)觀察足細胞敲除Sirt6糖尿病腎病小鼠足細胞內(nèi)H3K9乙?；降淖兓ｓw外研究中，利用蛋白免疫印跡方法檢測過表達Sirt6后對HG刺激下HPC中H3K9ac的影響。
　　3.2 足細胞內(nèi)Sirt6對Notch1和Notch4及下游靶基因HES1和Snail1表達水平的調(diào)控:
　　利用基因芯片篩選Sirt6的下游靶基因，通過熒光實時定量RT-PCR進一步確認過表達Sirt6后對HG刺激下HPC

8、中Notch1和Notch4的mRNA水平的調(diào)控。利用蛋白免疫印跡的方法觀察敲除HPC內(nèi)的Sirt6后，Notch1和Notch4的蛋白水平是否發(fā)生上調(diào)。
　　3.3 足細胞中Sirt6通過調(diào)控H3K9的乙?；接绊慛otch1和Notch4轉(zhuǎn)錄:
　　采用染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)方法檢測Notch1和Notch4啟動子是否位于H3K9位點，同時觀

9、察過表達Sirt6后對HG刺激下HPC中Notch1和Notch4啟動子區(qū)域H3K9位點乙酰化水平的調(diào)控。利用ChIP方法檢測Sirt6與Notch1和Notch4啟動子區(qū)域是否存在結(jié)合以及它們之間的結(jié)合在不同刺激下是否發(fā)生改變。
　　結(jié)果：
　　第一部分:SIRTs家族各成員在糖尿病腎病中的表達模式
　　1.1 在糖尿病腎病小鼠腎臟皮質(zhì)中Sirt1和Sirt6蛋白水平明顯下降:
　　蛋白免疫印跡結(jié)果表明在糖尿病

10、腎病小鼠腎臟皮質(zhì)中，Sirt1，Sirt3，Sirt4和Sirt6蛋白表達水平出現(xiàn)不同程度的降低，其中以Sirt1和Sirt6下降最明顯。
　　1.2 Sirt6在足細胞損傷相關(guān)腎病病人腎活檢標本中的表達都出現(xiàn)明顯下調(diào)，并且與腎小球率過濾、蛋白尿的生成密切相關(guān)。
　　1.3 在不同刺激下的HPC中，Sirt6蛋白表達水平都顯著降低:
　　蛋白免疫印跡表明，HG與AGE都可以顯著誘導HPC中的Sirt6蛋白表達水平顯著下

11、調(diào)。
　　第二部分:Sirt6在糖尿病腎病足細胞損傷中的作用
　　2.1 足細胞特異性敲除Srit6的小鼠的構(gòu)建及表型觀察:
　　鼠尾DNA提取后的基因型鑒定確證足細胞特異性敲除小鼠的構(gòu)建成功;免疫熒光雙標實驗進一步確認敲除小鼠足細胞內(nèi)Sirt6的蛋白表達明顯降低;蛋白免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎小球內(nèi)Sirt6的蛋白表達水平顯著下調(diào)。
　　2.2 敲除足細胞內(nèi)Sirt6加重糖尿病腎病小鼠足細胞損傷:
　　敲除足細胞

12、內(nèi)的Sirt6可以使糖尿病腎病小鼠蛋白尿水平進一步上升，加重腎小球系膜增生、足細胞足突的融合、足突數(shù)量的減少及腎小球基底膜的增厚。同時研究發(fā)現(xiàn)敲除Sirt6會進一步下調(diào)糖尿病腎病小鼠足細胞內(nèi)Nephrin，Podocin蛋白表達水平，上調(diào)uPAR的蛋白表達水平。
　　2.3 Sirt6通過多重保護作用改善足細胞損傷:
　　體外研究發(fā)現(xiàn)過表達Sirt6可以抑制HG刺激足細胞所引起的IL-1β等炎性相關(guān)因子水平的升高，降低足細胞

13、凋亡，改善足細胞骨架重排。另外，我們還發(fā)現(xiàn)Sirt6可以顯著恢復足細胞內(nèi)的自噬水平，抑制HG刺激所引起的自噬水平的降低。
　　第三部分:Sirt6改善糖尿病腎病足細胞損傷的作用機制
　　3.1 足細胞內(nèi)Sirt6可以調(diào)控H3K9位點的乙酰化水平:
　　免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病病人以及局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥病人的腎活檢標本中H3K9位點乙?；矫黠@升高。免疫熒光實驗顯示足細胞敲除Sirt6后會進一步上調(diào)糖尿病腎病小

14、鼠足細胞內(nèi)H3K9位點的乙?；健Ａ硗?，蛋白免疫印跡結(jié)果表明過表達Sirt6后可以顯著的下調(diào)HG刺激足細胞所引起的H3K9ac水平的升高。
　　3.2 Sirt6可以反向調(diào)控Notch1和Notch4及下游靶基因HES1和Snail1的表達:
　　基因芯片結(jié)果提示Sirt6蛋白水平的下調(diào)可能參與HG刺激的足細胞內(nèi)Notch信號通路的激活。熒光實時定量RT-PCR進一步確認過表達Sirt6后可以抑制HG刺激HPC中Notch

15、1和Notch4的mRNA水平的上調(diào)。體外研究發(fā)現(xiàn)敲低HPC內(nèi)的Sirt6后，Notch1和Notch4的蛋白水平顯著上調(diào);體內(nèi)研究進一步確認足細胞特異性敲除Sirt6后，糖尿病腎病小鼠足細胞內(nèi)Notch1和Notch4的蛋白水平明顯升高。
　　3.3 Sirt6通過調(diào)控H3K9位點乙酰化水平影響Notch1和Notch4轉(zhuǎn)錄:
　　首先ChIP結(jié)果發(fā)現(xiàn)HG刺激下HPC中Notch1和Notch4啟動子區(qū)域H3K9位點乙?；?/p>

16、水平出現(xiàn)明顯升高，過表達Sirt6可以抑制H3K9位點乙酰化水平的上調(diào)。其次，我們通過ChIP研究發(fā)現(xiàn)Sirt6與Notch1和Notch4啟動子區(qū)域存在結(jié)合，這種結(jié)合在HG刺激下明顯減少，過表達Sirt6后能夠得以恢復。
　　結(jié)論：
　　1.Sirt6的水平在足細胞損傷腎病病人腎臟中出現(xiàn)明顯下降，并且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Sirt6的mRNA水平與病人腎小球濾過率呈正相關(guān)，與蛋白尿水平呈負相關(guān)。
　　2.特異性敲除足細胞內(nèi)的

17、Sirt6后顯著加重糖尿病腎病小鼠足細胞的損傷以及蛋白尿的生成，并進一步發(fā)現(xiàn)Sirt6可以通過抗炎癥、抗凋亡、抑制足細胞骨架重排及提高足細胞自噬水平作用改善HG誘導的足細胞損傷。
　　3.在Sirt6足細胞保護作用機制的研究中，發(fā)現(xiàn)Sirt6可以通過降低H3K9位點的乙?；?，抑制Notch家族中Notch1和Notch4的轉(zhuǎn)錄及下游信號通路的激活，繼而發(fā)揮足細胞保護作用
　　4.本實課題首次發(fā)現(xiàn)Sirt6可以通過靶向調(diào)控