Megsin在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、目的：糖尿病腎病（DN）是糖尿病最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥。隨著全球范圍內(nèi)糖尿病（DM）發(fā)病率逐年升高，糖尿病腎病逐漸成為導(dǎo)致終末期腎衰竭（ESRF）的首位或主要病因，患者最終只能依靠透析或腎移植維持生命，嚴(yán)重影響了生存質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。如何早期有效防治糖尿病腎病是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外學(xué)者熱切關(guān)注的課題。
　　 糖尿病腎病的病理特征是腎小球系膜細(xì)胞增生、肥大，細(xì)胞外基質(zhì)積聚，最終發(fā)生腎小球硬化。腎小球系

2、膜細(xì)胞（GMC）是腎臟重要的固有細(xì)胞（inherent cell）之一，在腎臟的組織結(jié)構(gòu)和生理功能方面發(fā)揮著重要作用，具有產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)、分泌細(xì)胞因子、吞噬和清除異物等多種功能。腎小球系膜細(xì)胞也是多種致病因子作用的主要靶細(xì)胞，在病變進(jìn)展中扮演著重要角色。Megsin是一種系膜細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因，定位于18q21.3，編碼蛋白N末端可變反應(yīng)活性環(huán)（RSL）與絲氨酸蛋白酶結(jié)合，發(fā)揮絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）活性。Serpin家族成員眾

3、多，功能涉及凝血、纖溶、炎癥、細(xì)胞增殖、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、消化等多個(gè)系統(tǒng)，serpin與其作用底物絲氨酸蛋白酶之間的動(dòng)態(tài)平衡與機(jī)體各項(xiàng)生理活動(dòng)的正常進(jìn)行息息相關(guān)，推測(cè)megsin作為serpin的成員之一，勢(shì)必參與系膜細(xì)胞的某些生理活動(dòng)，探討megsin在腎小球系膜細(xì)胞中的作用對(duì)于深入揭示糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。
　　 本研究擬通過(guò)臨床和基礎(chǔ)研究?jī)煞矫?，觀察megsin在糖尿病狀態(tài)下腎組織中的表達(dá)變化；分別構(gòu)建megsi

4、n表達(dá)質(zhì)粒和megsin siRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染CD-1小鼠和小鼠腎臟系膜細(xì)胞，從整體、細(xì)胞和分子水平探討megsin與系膜細(xì)胞增殖程度、細(xì)胞外基質(zhì)代謝關(guān)鍵酶基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）/組織型抑制劑-2（TIMP-2）以及細(xì)胞周期抑制蛋白P27水平之間的關(guān)系，探討megsin在糖尿病腎病早期的致病機(jī)制；通過(guò)Sprague-dawlay（SD）大鼠糖尿病模型干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑（HCRI）

5、對(duì)腎組織megsin表達(dá)的影響，最終來(lái)闡明megsin參與早期糖尿病腎病發(fā)生的作用，篩選從基因或蛋白水平阻斷megsin致病作用的有效途徑，為進(jìn)一步闡明糖尿病腎病發(fā)病的分子機(jī)制及其防治提供一條新思路。
　　 方法：
　　 第一部分：從該院腎內(nèi)科2006年6月至2007年6月住院患者中選擇符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的2型糖尿病患者60例和原發(fā)性腎病綜合征患者38例，經(jīng)腎活檢病理檢查并結(jié)合臨床資料確診糖尿病腎病18例

6、和微小病變性腎小球病，確定為研究對(duì)象，另外5例正常腎組織（選自該院泌尿外科腎癌患者手術(shù)切除的腎臟病灶遠(yuǎn)周部分）作為正常對(duì)照組，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并半定量分析各組腎組織標(biāo)本中megsin的表達(dá)。
　　 第二部分：建立單側(cè)腎切除+鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的CD-1小鼠糖尿病模型，構(gòu)建megsin表達(dá)質(zhì)粒并經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染小鼠（C組，n=15），每周1次，同時(shí)設(shè)立單純單側(cè)腎切除組（A組，n=15）和單側(cè)腎切除+糖尿病+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（B組，n

7、=15），實(shí)驗(yàn)共12周，分別于第1、2和12周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標(biāo)本，測(cè)定血糖（BG）、血肌酐（Scr）、腎重/體重比值（KW/BW）、尿蛋白（UP），分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和western blot測(cè)定腎組織中megsin、MMP-2、TIMP-2、P27和Ⅳ型膠原的表達(dá)；建立穩(wěn)定表達(dá)megsin的小鼠系膜細(xì)胞株（D組），高糖環(huán)境中培養(yǎng)48小時(shí)，同時(shí)設(shè)立野生型小鼠系膜細(xì)胞正常糖培養(yǎng)組（A組）、高糖培養(yǎng)組（B組）和megsi

8、n質(zhì)粒對(duì)照+高糖培養(yǎng)組（C組），分別于12、24和48小時(shí)末收集各組細(xì)胞及上清，提取蛋白，應(yīng)用western blot測(cè)定各組總蛋白中megsin、MMP-2、TIMP-2和P27的表達(dá)，放免法測(cè)定細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（結(jié)果用總蛋白校正）。
　　 第三部分：動(dòng)物模型制備同第二部分，構(gòu)建megsin siRNA表達(dá)質(zhì)粒并經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染糖尿病小鼠（C組，n=15），每周1次，同時(shí)設(shè)立單純單側(cè)腎切除組（A組，n=15）和單側(cè)腎切

9、除+糖尿病+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（B組，n=15），實(shí)驗(yàn)共12周，分別于第1、2和12周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標(biāo)本，測(cè)定血糖（BG）、血肌酐（Scr）、腎重/體重比值（KW/BW）、尿蛋白（UP），分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和western blot測(cè)定腎組織中megsin、MMP-2、TIMP-2、P27和Ⅳ型膠原的表達(dá)；體外培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)胞，應(yīng)用脂質(zhì)體2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染megsin siRNA質(zhì)粒，高糖環(huán)境中培養(yǎng)48小時(shí)，同時(shí)設(shè)立小鼠系膜

10、細(xì)胞正常糖培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)組和空質(zhì)粒+高糖培養(yǎng)組，分別于12、24和48小時(shí)末收集各組細(xì)胞及上清，提取蛋白，應(yīng)用western blot測(cè)定各組總蛋白中megsin、MMP-2、TIMP-2和P27的表達(dá)，放免法測(cè)定細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（結(jié)果用總蛋白校正）。
　　 第四部分：建立鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的SD大鼠糖尿病模型，給予氟伐他汀干預(yù)（2mg·kg-1·d-1灌胃，DF組，n=6），同時(shí)設(shè)立糖尿病對(duì)照組（DC組，n=6）和正常對(duì)

11、照組（NC組，n=6），于實(shí)驗(yàn)第6周末用代謝籠收集各組大鼠血、尿及腎組織標(biāo)本，測(cè)定BG、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血肌酐（Scr）和尿肌酐（Ucr），并計(jì)算肌酐清除率（Ccr），結(jié)果用體重校正，放免法測(cè)定24h尿白蛋白排泄率（UAER），免疫組織化學(xué)染色半定量分析各組大鼠腎組織megsin、Ⅳ型膠原和層黏連蛋白（LN）的表達(dá)，并行腎組織過(guò)碘酸-希夫（PAS）染色，普通光鏡下觀察腎小球病理學(xué)改變。
　　 結(jié)果：

12、>　　 第一部分：正常腎組織和微小病變性腎小球病患者腎組織中megsin在腎小球系膜區(qū)無(wú)表達(dá)或僅微弱表達(dá)，兩組間差異無(wú)顯著性，而在糖尿病腎病患者腎組織腎小球表達(dá)增強(qiáng)，與其他兩組比較差異有顯著性。
　　 第二部分：
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)糖尿病小鼠成模4～5天后出現(xiàn)多飲、多食、多尿表現(xiàn)；第1周末B組小鼠腎小球固有細(xì)胞數(shù)目增多，免疫組化和western blot結(jié)果顯示腎小球megsin、TIMP-2、P27和Ⅳ型膠原表達(dá)增強(qiáng)

13、，MMP-2表達(dá)減弱，C組變化更顯著，三組間差異有顯著性意義；第2周末上述各指標(biāo)變化更為明顯，三組間比較有顯著性差異；第12周末B組小鼠腎小球固有細(xì)胞數(shù)目減少，與A組無(wú)差異，P27表達(dá)水平回落，但仍高于A組，與C組無(wú)差異，其他指標(biāo)如megsin、TIMP-2和Ⅳ型膠原進(jìn)一步增強(qiáng)，但仍弱于C組，MMP-2表達(dá)水平進(jìn)一步降低，但仍高于C組。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)從12h開(kāi)始，B組較A組小鼠系膜細(xì)胞megsin、P27和TIMP-2蛋白

14、水平開(kāi)始升高，48h達(dá)到高峰，48h時(shí)MMP-2水平降至最低，C組和B組相比差異無(wú)顯著性，但D組變化趨勢(shì)更明顯，與B組和C組相比差異有顯著性意義；從12h開(kāi)始，B組小鼠系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（細(xì)胞總蛋白校正）較A組開(kāi)始升高，48h達(dá)到高峰，C組與B組相比差異無(wú)顯著性，但D組系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度升高最明顯，與其他組相比差異有顯著性意義。
　　 第三部分：
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)糖尿病小鼠成模4～5天后出現(xiàn)與第二部

15、分類似的糖尿病癥狀；第1周末B組小鼠與A組相比，腎小球固有細(xì)胞數(shù)目增多，免疫組化和western blot結(jié)果顯示腎小球megsin、TIMP-2、P27和Ⅳ型膠原表達(dá)增強(qiáng)，MMP-2表達(dá)減弱，C組上述各指標(biāo)介于A組和B組之間，三組間差異有顯著性意義；第2周末B組小鼠腎小球固有細(xì)胞數(shù)目、組織中megsin、MMP-2、TIMP-2、P27和Ⅳ型膠原表達(dá)變化更明顯，C組上述各指標(biāo)介于A組和B組之間，三組間比較有顯著性差異；第12周末B組小

16、鼠腎小球固有細(xì)胞數(shù)目減少，P27表達(dá)水平下降。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)從12h開(kāi)始，B組較A組小鼠系膜細(xì)胞megsin、P27和TIMP-2蛋白水平開(kāi)始升高，48h達(dá)到高峰，48h時(shí)MMP-2水平降至最低，C組和B組相比差異無(wú)顯著性；D組與B組或C組同期相比，megsin、P27和TIMP-2蛋白水平降低，MMP-2升高，差異有顯著性意義。
　　 第四部分：實(shí)驗(yàn)第6周末DF組和DC組大鼠血糖無(wú)差異，但均高于NC組； DC組大

17、鼠腎小球嗜PAS陽(yáng)性物輕度增多，固有細(xì)胞數(shù)目增多，血清中TC、TG、Ccr、UAER、腎臟/體重比值以及免疫組化結(jié)果顯示組織中megsin、Ⅳ型膠原和層黏連蛋白水平高于NC組，DF組上述指標(biāo)低于DC組，但高于NC組，三組間差異有顯著性意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，糖尿病狀態(tài)下megsin在腎小球表達(dá)增強(qiáng)，與腎小球系膜增殖、細(xì)胞外基質(zhì)積聚相一致，提示megsin在糖尿病腎病發(fā)生機(jī)制中起一定作用。

18、>　　 2.體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)megsin可上調(diào)腎組織或系膜細(xì)胞TIMP-2、P27的表達(dá)，下調(diào)MMP-2的表達(dá)，提示megsin促發(fā)糖尿病腎病發(fā)生的機(jī)制與MMP-2/TIMPs和P27有關(guān)，但具體作用途徑有待進(jìn)一步研究闡明。
　　 3.megsin siRNA質(zhì)粒和HMG-CoA還原酶抑制劑可分別從基因水平和蛋白水平下調(diào)megsin的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)TIMP-2和P27、上調(diào)MMP-2在腎組織中的表達(dá)來(lái)延緩系膜增殖、細(xì)