雷帕霉素調(diào)控足細(xì)胞自噬在糖尿病腎病中的作用研究.pdf

1、研究背景及意義
　　糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetic Mellitus,DM)最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致終末期腎病的首要原因。早期DN的病理特征主要包括系膜基質(zhì)聚集和腎小球基底膜增厚,DN進(jìn)展的病理學(xué)標(biāo)志是腎小球結(jié)節(jié)性硬化與腎間質(zhì)纖維化,而尿蛋白持續(xù)性增多是DN的臨床特征,也是導(dǎo)致不可逆性腎衰竭的主要原因。因此,對(duì)DM的早期干預(yù)成為DN重要的防治措施。
　　足細(xì)胞作

2、為腎小球?yàn)V過(guò)屏障的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一,它能夠有效阻止血漿蛋白的漏出。已有許多研究認(rèn)為足細(xì)胞數(shù)量減少是腎臟疾病如DN進(jìn)展和局灶節(jié)段性硬化的前兆,足細(xì)胞的損傷和丟失會(huì)嚴(yán)重破壞腎小球?yàn)V過(guò)屏障的完整性,促使腎小球發(fā)生硬化。腎小球的不斷硬化將導(dǎo)致腎功能不可逆性喪失,最終發(fā)展至終末腎衰竭期。足細(xì)胞數(shù)量減少與其基本缺乏再生能力有關(guān),而糖尿病等應(yīng)激因素往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受損的蛋白和細(xì)胞器積聚,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,若不能及時(shí)清除就會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死,引起不可逆性的足

3、細(xì)胞損傷和功能失調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞缺失。因此,減少足細(xì)胞損傷和穩(wěn)定足細(xì)胞數(shù)量可能是延緩DN進(jìn)展的一個(gè)有效措施。
　　自噬即細(xì)胞的自我吞噬,是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的降解機(jī)制,也是真核細(xì)胞一種固有的生理功能,對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和細(xì)胞生存至關(guān)重要,它能夠通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的溶酶體有效清除和降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和有害物質(zhì),并將降解產(chǎn)物送至胞漿重新利用。正常情況下足細(xì)胞具有較高的自噬活性,已有研究證明足細(xì)胞自噬缺陷是導(dǎo)致蛋白尿和腎小球硬化的重要觸發(fā)點(diǎn),因

4、此自噬對(duì)穩(wěn)定足細(xì)胞數(shù)量和減輕足細(xì)胞損傷具有重要作用。
　　雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在自噬信號(hào)通路中占有樞紐地位。mTOR是一個(gè)重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在進(jìn)化上非常保守,它對(duì)細(xì)胞自噬起著負(fù)調(diào)控作用,mTOR活化可以抑制自噬體形成,許多因素對(duì)自噬的影響都與mTOR的活性變化有關(guān)。新近研究表明,足細(xì)胞mTOR活化是DN發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),減弱足細(xì)胞mTOR活化可以顯著

5、抑制DN進(jìn)展。但mTOR、足細(xì)胞自噬和DN三者之間的關(guān)系尚缺乏深入研究,作為自噬的負(fù)調(diào)控因子,mTOR活化將不可避免的導(dǎo)致足細(xì)胞自噬減弱。我們推測(cè),DN的發(fā)生和發(fā)展可能與mTOR活化后自噬減弱導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷和缺失有關(guān),而抑制足細(xì)胞mTOR活化,維持自噬平衡可能是DN的重要治療靶點(diǎn)。
　　雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)是由美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)在臨床上用于器官移植后抑制排斥反應(yīng)的藥物,它能特異的與mTOR激酶結(jié)合,抑制

6、mTOR活性,從而誘導(dǎo)自噬。本研究課題首先明確由鏈尿佐菌素(Streptozotocin,STZ)制備的Ⅰ型糖尿病(Diabetic mellitus,DM)小鼠足細(xì)胞自噬與DN的關(guān)系,然后觀察雷帕霉素對(duì)DM小鼠足細(xì)胞自噬水平、mTOR活性和DN的影響。我們的研究結(jié)果表明,雷帕霉素腹腔注射可減少DM小鼠尿白蛋白的排泄,減輕足細(xì)胞損傷,從而延緩小鼠DN進(jìn)展,并且雷帕霉素的上述作用可能與促進(jìn)足細(xì)胞自噬、抑制足細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　研究方

7、法
　　1、健康雄性Balb/c小鼠36只,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分組法分為三組:正常對(duì)照組(Control組,n=12)、糖尿病組(DM組,n=12)和雷帕霉素處理組(DM+Rapa組,n=12)。采用腹腔注射STZ誘導(dǎo)DM小鼠模型,待DM模型成功后即予以腹腔注射雷帕霉素,注射劑量為2mg/kg/48h。
　　2、雷帕霉素注射0、2、4、8、12周后分別稱取各組小鼠體質(zhì)量,并采用尾靜脈針刺取血的方法檢測(cè)血糖。12周留取24h尿標(biāo)

8、本,測(cè)定小鼠尿白蛋白(Urinary albumin,UA)和肌酐,計(jì)算尿蛋白/肌酐值(Urinary albumin creatinine,UACR);心臟取血檢測(cè)血肌酐(Serum creatinine,Scr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN),并在12周后取腎臟稱重,計(jì)算腎質(zhì)量/體質(zhì)量比(Kidney weight/Body weight,KW/BW)。
　　3、雷帕霉素注射12周后各組小鼠的腎臟

9、組織行PAS染色觀察腎臟病理改變,透射電鏡和免疫熒光染色分別觀察足細(xì)胞內(nèi)自噬體大小、數(shù)量和足細(xì)胞損傷情況。Western blot檢測(cè)足細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3(Microtubules associated protein1 light chain3,LC3)、p-mTOR、p-p70S6K(mTOR通路下游靶蛋白)、凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)變化。免疫熒光、Western blot和免疫組織化學(xué)染色分別檢測(cè)足細(xì)胞標(biāo)志物

10、Nephrin、Podocin和WT-1蛋白表達(dá)的變化,以此觀察腎小球足細(xì)胞的數(shù)量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、與對(duì)照組相比,DM組小鼠血糖、UACR、腎質(zhì)量/體質(zhì)量明顯升高;雷帕霉素處理后,DM小鼠尿蛋白的排出減少,腎質(zhì)量/體質(zhì)量值降低,而血糖無(wú)明顯變化。
　　2、PAS染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)DM組小鼠腎小球基底膜增厚,系膜基質(zhì)增多,WT-1免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn) DM組小鼠腎小球內(nèi)足細(xì)胞數(shù)量明顯減少;雷帕霉素腹腔注射12周后,DM

11、小鼠腎小球系膜基質(zhì)明顯減少,足細(xì)胞損傷減輕而數(shù)量增多,腎小球病理變化得到改善。
　　3、透射電鏡結(jié)果提示,DM組小鼠腎小球基底膜增厚,足細(xì)胞足突增寬融合,足細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量減少;雷帕霉素腹腔注射12周后,DM小鼠足細(xì)胞損傷減輕,自噬體的數(shù)量明顯增多。
　　4、Western Blot結(jié)果表明,DM組小鼠足細(xì)胞自噬體活化的分子標(biāo)志物 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值下降,p-mTOR和p-p70S6K蛋白表達(dá)明顯增多,免疫熒光染色

12、發(fā)現(xiàn)DM組小鼠足細(xì)胞內(nèi) LC3蛋白表達(dá)明顯下調(diào),腹腔注射雷帕霉素12周后,DM小鼠腎小球足細(xì)胞內(nèi)的LC3蛋白表達(dá)明顯上調(diào),p-mTOR和p-p70S6K蛋白表達(dá)明顯下調(diào),說(shuō)明雷帕霉素可以通過(guò)抑制過(guò)度激活的mTOR信號(hào)通路而提高足細(xì)胞自噬水平。
　　5、Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),DM組小鼠足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin和Podocin表達(dá)明顯減少,凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)明顯增多,免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞Ne

13、phrin蛋白表達(dá)下降,免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示W(wǎng)T-1陽(yáng)性足細(xì)胞數(shù)量減少,而雷帕霉素腹腔注射12周,DM小鼠足細(xì)胞標(biāo)志物Nephrin、Podocin和WT-1的蛋白表達(dá)明顯增加,凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)則顯著降低,這提示雷帕霉素治療可以維持DM小鼠足細(xì)胞數(shù)量,抑制足細(xì)胞凋亡。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　1、DM小鼠出現(xiàn)明顯的足細(xì)胞損傷和足細(xì)胞數(shù)量減少,足細(xì)胞自噬水平降低。
　　2、雷帕霉素腹腔注射可明顯減