精原干細(xì)胞動態(tài)標(biāo)記物的初步篩選.pdf

1、精原干細(xì)胞移植對男性不育的治療具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，尤其對青春期前接受大劑量化療致生精功能嚴(yán)重受損的非梗阻性無精子癥患者，具有獨(dú)特的臨床應(yīng)用價(jià)值。只要在非梗阻性無精子癥患者睪丸內(nèi)找到精原干細(xì)胞，就有可能促使其增殖分化獲得精子；或通過特異性標(biāo)志物分選，體外獲得純度較高的精原干細(xì)胞用于增殖培養(yǎng)或移植。然而，如何確定所獲得細(xì)胞是精原干細(xì)胞，成為此項(xiàng)工作的首要條件。精原干細(xì)胞在增殖和分化的過程中細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)會表達(dá)許多蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)如果

2、有較好的特異性和敏感性，作為精原干細(xì)胞標(biāo)志物，將對分離及鑒定精原干細(xì)胞發(fā)揮重要作用。我們將不同年齡階段小鼠精原干細(xì)胞采用復(fù)合酶消化、免疫磁珠分選技術(shù)分離純化出后，通過雙向凝膠電泳及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)動態(tài)觀測各年齡階段精原干細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，運(yùn)用生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫篩選并確定差異性蛋白質(zhì)或發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)。
　　目的：利用iTRAQ蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)觀測各年齡階段精原干細(xì)胞（SSCs）蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步分析 SSCs標(biāo)志物表達(dá)

3、的動態(tài)變化，運(yùn)用生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫篩選并發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物。
　　方法：以健康雄性 C57BL/6小鼠為研究對象，按照年齡段不同分為8組，無菌提取各組小鼠睪丸組織，采用復(fù)合酶消化、免疫磁珠分選的方法純化 SSCs后提取蛋白，利用雙向電泳及 iTRAQ標(biāo)記蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)并結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對各組蛋白質(zhì)進(jìn)行分析鑒定。
　　結(jié)果：質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)共得到譜圖248510張，通過 Mascot軟件進(jìn)行分析，共鑒定到1132種蛋白。以蛋白豐

4、度差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)P?0.05視為存在差異性蛋白,8組共檢測到差異蛋白298種。鑒定到目前已知的 SSCs標(biāo)志物9種（PCNA、GFRA1、CDH1、Annexin A7、UCHL1、VASA、CD49f、CD29、PLZf），通過各組對比獲得在不同年齡段內(nèi)表達(dá)變化趨勢，其中GFRA1、CD49f、CD29在 SSCs中的變化趨勢與以往文獻(xiàn)一致，并篩選出10種蛋白質(zhì)（P63、CD71、CD98、K19、ACE、K