犬精原干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與EGFP基因轉(zhuǎn)染的初步研究.pdf

1、背景和目的：精原干細(xì)胞具有自我更新的能力，是雄性動物體內(nèi)唯一能進(jìn)行遺傳信息傳遞給后代的干細(xì)胞。因此，精原干細(xì)胞不但是研究精子發(fā)生、制作轉(zhuǎn)基因動物和研究基因功能的重要資源，而且是對于保護(hù)瀕臨滅絕的野生動物有重要意義。自1994年小鼠精原干細(xì)胞首次移植成功，精原干細(xì)胞已經(jīng)成為干細(xì)胞研究的熱點。隨后，精原干細(xì)胞移植技術(shù)在羊、牛、豬等動物上取得了較大的進(jìn)展，為研究精原細(xì)胞的生理學(xué)方面特點和鑒定精原干細(xì)胞群建立了一個有效的方法。然而，犬精原干細(xì)胞

2、的體外分離、培養(yǎng)及移植等技術(shù)尚無任何報道。本實驗研究了犬精原干細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染技術(shù)，初步建立了體外培養(yǎng)體系，為以后的移植技術(shù)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)并為精子的形成機制研究提供數(shù)據(jù)。 方法：選取不同年齡段的犬進(jìn)行睪丸HE染色的組織學(xué)觀察，篩選合適月齡的畢格犬用于精原干細(xì)胞的研究。犬睪丸生精上皮細(xì)胞的分離采用了四種酶組合消化方法(膠原酶Ⅳ；膠原酶Ⅳ+膠原酶Ⅳ；膠原酶Ⅳ+胰蛋白酶；膠原酶Ⅳ+透明質(zhì)酸酶+胰蛋白酶)，通過比較細(xì)胞活率(

3、臺盼藍(lán)斥染法)和細(xì)胞總數(shù)，得出最優(yōu)酶組合消化方法。根據(jù)睪丸支持細(xì)胞比精原細(xì)胞最先貼壁，可將精原細(xì)胞進(jìn)行初步純化，然后以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加不同濃度的血清(0％、1％、5％、10％和20％)或EGF(0 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、60 ng/ml和100 ng/ml)進(jìn)行培養(yǎng)，通過計細(xì)胞集落數(shù)以檢測對精原細(xì)胞生長情況的影響。采用陽離子聚合物和磷酸鈣的轉(zhuǎn)染方法，比較了質(zhì)粒pEGFP-N1M在精

4、原干細(xì)胞培養(yǎng)72h后的表達(dá)情況。 結(jié)果：犬睪丸內(nèi)精原細(xì)胞的數(shù)量隨日齡的增加而增多，但是6月齡的犬睪丸內(nèi)精原細(xì)胞已有明顯的分裂相，5月齡的犬睪丸內(nèi)未見分裂相，但大多數(shù)精原細(xì)胞直徑與6月齡的一致，4-4.5月齡的犬睪丸內(nèi)精原細(xì)胞直徑明顯減小，而且精原細(xì)胞數(shù)量較多，本實驗認(rèn)為4-4.5月齡是用于犬精原干細(xì)胞分離研究的最佳年齡段。四種不同酶組合方法所得細(xì)胞總數(shù)(每100mg睪丸組織)分別為：3.37±0.101×106個、3.96±0.

5、062×106個、4.35+0.110×106個和6.67+0.692×106個；細(xì)胞存活率分別為：82.4±1.94％、87.7±1.45％、89.7±0.88％和95.5±0.68％，膠原酶加胰蛋白酶的組合方法消化的效果最好(P<0.01)。經(jīng)貼壁法純化后精原干細(xì)胞的純化率為50.86％，此法簡單、易于操作，而且較好的保留了細(xì)胞的活力。在細(xì)胞培養(yǎng)體系的研究中發(fā)現(xiàn)，lO％血清比其他濃度組更好的促進(jìn)精原干細(xì)胞的生長。在含10％血清的DM

6、EM中添加不同濃度的EGF，結(jié)果顯示，20 ng/mlEGF能極其顯著的提高細(xì)胞集落數(shù)(P<0.01)。陽離子聚合物法和磷酸鈣法對精原干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率分別為22.14％和8.12％。 結(jié)論：本實驗首次建立了簡單有效的分離犬睪丸生精上皮細(xì)胞的方法，獲得了較多的細(xì)胞數(shù)和較好的存活率。犬精原干細(xì)胞在體外培養(yǎng)中可以存活1周并形成了細(xì)胞集落，表明此培養(yǎng)體系實現(xiàn)了精原干細(xì)胞的生長和增殖，但是精原干細(xì)胞的長期培養(yǎng)體系有待進(jìn)一步研究。犬精原干細(xì)胞