精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及自增殖相關(guān)因子的篩選與初步研究.pdf

1、為探索SSCs體外自增殖的條件及體外快速擴(kuò)增的方法。我們分離了6～8日齡昆明乳鼠的睪丸細(xì)胞，采用Percoll梯度離心法富集SSCs；將所得支持細(xì)胞用絲裂霉素C處理后作為飼養(yǎng)層，以DMEM為基本培養(yǎng)基，添加5％的FBS和10<'3>U/ml的LIF，培養(yǎng)SSCs；以SSCs特異性表面分子Thy-1為標(biāo)志，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了免疫熒光鑒定。結(jié)果表明，該體系下，SSCs貼壁時(shí)間為6 h～9 h，48 h后可見細(xì)胞分裂，迅速增殖出現(xiàn)在接種12

2、d以后。接種后第20 d形成數(shù)十至上百個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞總數(shù)增加了45～245倍，100倍光學(xué)顯微鏡觀察可見，單位視野內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)為26±4。原代培養(yǎng)20 d和傳代培養(yǎng)14 d的細(xì)胞為Thy-1陽(yáng)性。該培養(yǎng)體系適合SSCs短期快速增殖。 為了探索雌激素對(duì)隱睪小鼠SSCs增殖的影響，我們選取10日齡雄性昆明乳鼠，行隱睪手術(shù)后隨機(jī)分組，分別皮下注射不同劑量的17-雌二醇(E2)，連續(xù)處理35 d。結(jié)果表明，低劑量E2對(duì)隱睪小鼠SSC

3、s的增殖無(wú)明顯作用，但中等劑量和高劑量的E2能夠刺激其自增殖。此外，本研究依據(jù)抑制素B、FSH、E2、LH以及睪酮水平的變化，對(duì)E2促進(jìn)SSCs自增殖的調(diào)控機(jī)制作了探討。 鑒于此，為篩選SSCs自增殖相關(guān)因子，收集了高劑量E2(1 μg/g體重)處理組小鼠睪丸，提取總蛋白，應(yīng)用雙向電泳，分析E2處理組與對(duì)照組之間差異表達(dá)蛋白。結(jié)果顯示，4種差異表達(dá)蛋白被鑒定為HERP，PEBP1，Stathmin蛋白和一個(gè)未命名蛋白(Px)。其

4、中，HERP在各不同處理組表達(dá)量為：雌二醇處理組>隱睪對(duì)照組>正常對(duì)照組；另外3種蛋白與此相反。 在此基礎(chǔ)上，克隆了Stathmin的基因，構(gòu)建了pEGFP-stathmin融合基因，分別轉(zhuǎn)染了SSCs和睪丸支持細(xì)胞。同時(shí)，對(duì)stathmin基因的mRNA進(jìn)行了原位雜交定位。結(jié)果顯示，stathmin基因的mRNA強(qiáng)表達(dá)于小鼠精原細(xì)胞，弱表達(dá)于初級(jí)精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞；轉(zhuǎn)染stathmin基因后，培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，Stat