MANF對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是最常見的一種肝癌分型，是我國最常見的惡性腫瘤之一，病因復(fù)雜。盡管早期的診斷與治療有了顯著的提高，但由于缺乏適當(dāng)?shù)闹委煷胧?，肝癌病人的生存率仍然微乎其微。肝癌通常是在慢性炎癥的基礎(chǔ)上由纖維化發(fā)展而來。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)應(yīng)激是在蛋白未折疊或者錯誤折疊時，激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfold protein response,UPR)，

2、減少細(xì)胞內(nèi)的異常蛋白的堆積，從而保護(hù)細(xì)胞的一種真核細(xì)胞的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)。已有研究表明，有很多的疾病的形成與發(fā)展均與ERS密切相關(guān)。中腦星形細(xì)胞來源的神經(jīng)生長因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)是一個ER應(yīng)激敏感蛋白，ER應(yīng)激能上調(diào)其表達(dá)。本實驗室早期研究中發(fā)現(xiàn)：在蛋白水平和mRNA水平，肝癌組織的MANF表達(dá)均高于癌旁組織，故推測，MANF可能在肝癌中起

3、著重要的作用。因此，本文擬探究MANF對肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響。
　　目的：
　　觀察MANF對肝癌細(xì)胞的體外增殖、遷移、侵潤及體內(nèi)成瘤的抑制作用。
　　方法：
　　收集肝癌病人組織樣本，采用免疫組化方法觀察MANF蛋白在肝癌和癌旁組織中表達(dá)的差異；構(gòu)建穩(wěn)定的敲低 MANF的肝癌細(xì)胞株，然后用MTT法、劃痕法、Transwell、軟克隆形成實驗分別觀察敲低MANF對腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及單個細(xì)胞惡性

4、增殖能力的影響；裸鼠成瘤實驗檢測MANF對腫瘤增長過程的影響。
　　結(jié)果：
　　1.觀察MANF在HCC樣本中的表達(dá)
　　對收集的HCC病人肝組織進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在癌旁組織MANF蛋白表達(dá)上調(diào)，而癌組織MANF蛋白表達(dá)低于癌旁組織。使用原位雜交的方法檢測MANF的mRNA時發(fā)現(xiàn)，HCC病人肝癌組織MANF表達(dá)低于其自身癌旁組織。上述結(jié)果提示，在肝癌MANF的轉(zhuǎn)錄及翻譯是被抑制的。
　　2.MANF對肝癌細(xì)胞

5、增殖的影響
　　構(gòu)建穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染對照載體的細(xì)胞株，利用MTT的方法檢測細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低MANF的肝癌細(xì)胞增殖率高于其載體對照，這一結(jié)果提示，MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖。
　　3.MANF對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響
　　使用已構(gòu)建的穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞株與其對照細(xì)胞株，利用劃痕實驗方法檢測MANF對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低MANF的肝癌細(xì)胞遷移能力高于其對照組細(xì)胞株，

6、這一結(jié)果提示，MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力。
　　4.MANF對肝癌細(xì)胞侵襲的影響
　　使用已構(gòu)建的穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞株與其對照細(xì)胞株，利用Transwell的方法檢測MANF對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低MANF的肝癌細(xì)胞侵襲率高于其對照組，該結(jié)果提示，MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲。
　　5.MANF對肝癌細(xì)胞惡性克隆能力的影響
　　使用已構(gòu)建的穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞株與其對照細(xì)胞株

7、，利用平板克隆形成實驗與軟克隆瓊脂形成實驗方法檢測MANF對肝癌細(xì)胞惡性克隆能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低MANF的肝癌細(xì)胞惡性克隆能力高于其對照組細(xì)胞株，這一結(jié)果提示，MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的惡性克隆形成。
　　6.MANF對裸鼠成瘤的影響
　　在裸鼠成瘤實驗中，我們從南京模式動物研究所購買了4-6周的雌性裸鼠，經(jīng)適應(yīng)性培養(yǎng)后，隨機(jī)分為兩組，一組皮下注射了穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞，另一組注射未敲低MANF的對照的肝癌細(xì)胞。結(jié)

8、果發(fā)現(xiàn)，注射敲低MANF肝癌細(xì)胞的裸鼠皮下腫瘤大于注射未敲低MANF肝癌細(xì)胞的裸鼠腫瘤。在裸鼠成瘤后，我們對皮下注射了穩(wěn)定敲低MANF的肝癌細(xì)胞的裸鼠再給予尾靜脈注射MANF與其對照PBS治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射MANF治療的裸鼠腫瘤小于注射PBS的裸鼠腫瘤。這一結(jié)果提示，MANF可以抑制裸鼠腫瘤的生長。
　　結(jié)論：
　　1.MANF在HCC中的表達(dá)下調(diào)；
　　2.MANF可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及單個細(xì)胞惡性