RNF2抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為及其與MANF相互作用的研究.pdf

1、環(huán)指蛋白2（ring finger protein2，Ring2又稱RNF2或Ring1b）是一個(gè)具有環(huán)指（ring finger）結(jié)構(gòu)的泛素連接酶（E3），屬于多梳蛋白家族（polycomb group，PcG）中多梳抑制子復(fù)合物1(polycomb repressor complex1,PRC1)中的一員，可介導(dǎo)組蛋白H2A的第119位賴氨酸的泛素化，從而影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，具有基因轉(zhuǎn)錄抑制的作用。PcG家族中的很多蛋白都與腫瘤的發(fā)生

2、和發(fā)展具有密切聯(lián)系，而關(guān)于RNF2在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中所起的作用及其具體機(jī)制仍不明確。RNF2作為一個(gè)通過酵母雙雜交篩選出的與中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）具有相互作用的蛋白，在HCC細(xì)胞和組織中也與MANF存在密切的相關(guān)性。MANF是一種可被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endopla

3、smic reticulum stress，ERS）所誘導(dǎo)的分泌性蛋白，我們的研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)HCC也有抑制作用。而RNF2可劑量依賴性的調(diào)節(jié)MANF的蛋白水平，因此我們推測(cè)RNF2對(duì)HCC的抑制作用可能是通過與MANF的相互作用而實(shí)現(xiàn)。
　　目的：
　　1.觀測(cè)RNF2在人肝細(xì)胞癌及非癌組織中的表達(dá)及與病人預(yù)后的關(guān)系；
　　2.研究RNF2對(duì)肝癌細(xì)胞的影響；
　　3.證明RNF2和MANF的相互作用；
　　方

4、法：
　　在SMMC-7721細(xì)胞和TEL-7402細(xì)胞中，采用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡法檢測(cè)caspase-3等方法證明RNF2對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響；用平板實(shí)驗(yàn)、軟克隆瓊脂實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等研究RNF2對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用；采用細(xì)胞免疫熒光、組織免疫熒光、組織免疫共沉淀驗(yàn)證RNF2和MANF在HCC中的相互作用；分別用tunicamycin（TM）和oxygen glucose depriv

5、ation（OGD）處理SMMC-7721和TEL-7402細(xì)胞，模擬HCC病人體內(nèi)的應(yīng)激和缺糖缺氧狀態(tài)，在沉默和過表達(dá)RNF2之后，用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)MANF的基因和蛋白表達(dá)情況；在SMMC-7721細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染RNF2-myc質(zhì)粒（0μg，0.25μg，0.5μg，1.0μg），并分別用TM和OGD處理之后，用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MANF的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1. RNF2在人肝細(xì)

6、胞癌和非癌肝臟組織中的表達(dá)
　　用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)RNF2在150例的肝細(xì)胞癌病人和136例的非腫瘤對(duì)照肝臟組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNF2在所有的病例中都有表達(dá)，且與非癌對(duì)照比較，肝細(xì)胞癌病人的肝臟組織中RNF2高表達(dá)的比率顯著下降（p<0.01）。
　　2. RNF2可以增加糖氧剝奪（OGD）處理后肝癌細(xì)胞的死亡
　　在SMMC-7721細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RNF2的過表達(dá)質(zhì)粒以及siRNA，經(jīng)OGD處理2.5

7、h之后，用PI對(duì)其進(jìn)行染色，對(duì)視野下紅色的PI陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RNF2之后，死亡細(xì)胞增加；沉默了RNF2之后，死亡細(xì)胞減少，提示RNF2可能會(huì)促進(jìn)在缺糖缺氧情況下肝癌細(xì)胞的死亡。
　　3. RNF2促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡
　　SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RNF2-siRNA質(zhì)粒并經(jīng)過OGD處理，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，用免疫印跡技術(shù)檢測(cè) caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果

8、RNF2可以促進(jìn)OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及caspase-3的表達(dá)。
　　4. RNF2對(duì)HCC細(xì)胞惡性行為學(xué)的影響
　　4.1 RNF2抑制肝癌細(xì)胞的增殖
　　在SMMC-7721和TEL-7402細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染RNF2-siRNA和RNF-myc質(zhì)粒，用MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值以及單個(gè)細(xì)胞克隆形成能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沉默RNF2之后，細(xì)胞的增殖能力增加，過表達(dá)RNF2使細(xì)胞的增殖能力減弱。用流式細(xì)胞

9、儀檢測(cè)細(xì)胞的活力也發(fā)現(xiàn)在沉默RNF2之后，細(xì)胞的增殖能力增加。
　　4.2 RNF2抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力
　　用劃痕實(shí)驗(yàn)觀測(cè)了分別轉(zhuǎn)染RNF2-siRNA和RNF2-myc質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默了RNF2之后，細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，而過表達(dá)RNF2使細(xì)胞的遷移能力減弱，該結(jié)果提示RNF2對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移具有抑制作用。
　　4.3 RNF2對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲能力具有抑制作用
　　在分別沉默和過表達(dá)RN

10、F2的SMMC-7721和TEL-7402細(xì)胞中，用transwell實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果表明在沉默了RNF2的細(xì)胞組中，穿過T4小孔的細(xì)胞數(shù)比轉(zhuǎn)染載體對(duì)照的細(xì)胞增多；相反，過表達(dá)RNF2可抑制細(xì)胞的遷移，提示RNF2可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　5. RNF2和MANF在SMMC-7721細(xì)胞核中共定位
　　SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)TM處理6 h或者經(jīng)OGD處理2.5 h之后，用免疫熒光雙標(biāo)觀察RNF2和M

11、ANF的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞經(jīng)上述處理之后，MANF和RNF2在細(xì)胞核中共定位。
　　6. RNF2和MANF在HCC病人的肝臟組織中共定位
　　肝細(xì)胞癌病人的肝臟組織經(jīng)包埋切片之后，用免疫熒光雙標(biāo)方法檢測(cè)RNF2和MANF在組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明兩者在肝癌組織中也存在共定位現(xiàn)象。
　　7. RNF2和MANF在肝組織中的相互作用
　　為觀察RNF2和MANF在肝癌組織中是否存在相互作用，我們將肝癌組

12、織研磨提取蛋白之后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。用RNF2抗體沉淀組織中的RNF2蛋白，用IB檢測(cè)免疫沉淀物中是否有MANF；同時(shí)用抗MANF的抗體共沉淀RNF2。結(jié)果提示，RNF2可以與MANF在肝癌組織中相互作用。
　　8. RNF2不影響MANF基因的轉(zhuǎn)錄
　　在SMMC-7721細(xì)胞中沉默RNF2或者轉(zhuǎn)染過表達(dá)RNF2的質(zhì)粒，用RT-PCR的方法檢測(cè)MANF基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在沉默RNF2還是過表達(dá)RNF2的細(xì)胞中

13、，與對(duì)照組相比MANF的mRNA水平幾乎保持不變。
　　9. RNF2影響MANF的蛋白水平
　　在SMMC-7721細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RNF2-siRNA或RNF2-myc質(zhì)粒，采用免疫印跡方法檢測(cè)MANF的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明在沉默RNF2之后MANF的表達(dá)下調(diào)；而在過表達(dá)RNF2之后MANF的表達(dá)上調(diào)；用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)MANF的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在RNF2被沉默的細(xì)胞中，MANF的表達(dá)也低，而在RNF2被過表達(dá)的細(xì)胞

14、中，MANF的表達(dá)量也上調(diào)。
　　10. RNF2劑量依賴性的調(diào)節(jié)MANF的蛋白水平
　　在SMMC-7721細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染RNF2-myc質(zhì)粒0μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg，并分為對(duì)照組、TM刺激組（6 h）、OGD刺激組（2.5 h），用免疫印跡方法來檢測(cè)MANF的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著RNF2-myc轉(zhuǎn)染劑量的逐漸增加MANF的蛋白水平也逐漸增加。提示MANF在蛋白水平上對(duì)RNF2存在劑量依賴性。<