紫球藻藻紅蛋白β亞基基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、福建師范大學(xué)碩士學(xué)位論文紫球藻藻紅蛋白β亞基基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)姓名：吳義誠(chéng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：陳必鏈20090401中文文摘中文文摘紫球藻( P o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ) 是一種紅藻門單細(xì)胞藻。在生長(zhǎng)過程中，能合成大量的藻紅蛋白和胞外多糖等有效活性物質(zhì)。隨著藻紅蛋白( ( P h y e o e r y t h r i n ，P E ) 在醫(yī)藥和工業(yè)

2、領(lǐng)域的需求增大，高額的海藻養(yǎng)殖成本以及藻紅蛋白純化費(fèi)用已成為藻紅蛋白廣泛應(yīng)用的一個(gè)重要制約因素。加強(qiáng)藻紅蛋白基因結(jié)構(gòu)、基因功能的研究，對(duì)闡明光合作用分子機(jī)制、質(zhì)體起源與進(jìn)化等重大的理論以及與提高光合效率進(jìn)而提高作物產(chǎn)量等實(shí)際問題都具有重要的理論和實(shí)踐意義。另外利用發(fā)酵生產(chǎn)藻紅蛋白，提供食用和飼料蛋白，及利用藻膽蛋白基因?qū)Υ笮徒?jīng)濟(jì)海藻蛋白質(zhì)性狀進(jìn)行基因工程改良，都需要藻膽蛋白基因結(jié)構(gòu)和功能研究的進(jìn)展和突破。紫球藻細(xì)胞富含多糖和藻紅蛋白等次

3、生代謝產(chǎn)物，因而紫球藻基因組D N A 提取的關(guān)鍵步驟之一就是這些物質(zhì)與基因組D N A 的分離，使其D N A 釋放到抽提緩沖液中，此外還要考慮次級(jí)代謝產(chǎn)物及其相關(guān)酶類等雜質(zhì)的影響。本研究根據(jù)所選材料的特點(diǎn)，選取廣泛應(yīng)用于植物及真菌D N A 提取的五種方法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示提取的基因組D N A 大小均約2 3k b ，五種方法所提的D N A 純度及產(chǎn)率有差別，蛋白酶K 法提取的D N A 褥率最大達(dá)3 ．3 l l a g ／I

4、 - t L ，C T A B 方法次之，但蛋白酶K 法提取的D N A 含有一些蛋白及R N A 等雜質(zhì)，改良C T A B 法提取的D N A 樣品完整性相對(duì)較好，A 2 6 0 ／A 2 3 0 和A 2 6 0 ／A 2 8 0 分別為2 ．0 9 和1 ．8 5 。綜合D N A 提取純度、得率、P C R 擴(kuò)增和酶切效果，C T A B 法是五種方法中最適合紫球藻基因組D N A 提取的方法。近十幾年來，藻紅蛋白分子生物學(xué)的

5、研究進(jìn)展較快，到目前為止，已對(duì)十幾種藻的藻紅蛋白基因進(jìn)行了克隆和序列分析，其中主要是來自紅藻和藍(lán)藻。本研究是通過從N C B I基因庫(kù)中查閱到有關(guān)紅藻門藻紅蛋白基因序列，用C l u s t a l X l ．8 3 軟件對(duì)所查找的序列進(jìn)行比對(duì)，得到紫球藻藻紅蛋白p 亞基基因兩側(cè)保守序列。利用生物軟件P r i m e r P r e m i e r 5 ．0 和O l i g o6 ．0 對(duì)該序列設(shè)計(jì)引物，再經(jīng)過P C R 、R T

6、- P C R 等技術(shù)，首次完成了紫球藻藻紅蛋白B 亞基、間隔序列及Q 亞基編碼區(qū)近5 ’端c D N A 序列和基因組D N A 序列的克隆及序列測(cè)定。其中1 3 亞基e D N A 全長(zhǎng)由5 3 4 個(gè)堿基組成；c D N A 序列排布順序?yàn)? ' U T R - r p e B ．間隔區(qū)．r p e A ；對(duì)紫球藻藻紅蛋白p 亞基基因組結(jié)構(gòu)分析表明，其基因編碼區(qū)無內(nèi)含子序列，由紫球藻藻紅蛋白p 亞基c D N A 序列推導(dǎo)