快速測序技術(shù)的開發(fā)及其在病原菌鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、背景目的：
　　傳統(tǒng)的致病菌檢測鑒定主要依據(jù)形態(tài)特征和生理性狀，采取的主要方法是對細(xì)菌進(jìn)行增菌、分離、純培養(yǎng)，然后從形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特征、血清免疫學(xué)，酶免疫技術(shù)等加以鑒定。傳統(tǒng)方法雖然可靠，但耗時耗力，不能滿足現(xiàn)代疾病診斷治療的速度要求。近年來，由于測序技術(shù)的提高和普及，國際DNA序列數(shù)據(jù)庫及比對程序的完善，使得測序逐漸地開始應(yīng)用于病原菌的檢測。測序法與其它分子生物學(xué)方法相比，其最大的優(yōu)點(diǎn)在于無需借助與標(biāo)準(zhǔn)菌株的比對，便可直接

2、得出結(jié)果，也無需使用其它方法進(jìn)行確證，是細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究旨在改良傳統(tǒng)Sanger測序技術(shù)，建立16S rRNA基因快速測序法，并應(yīng)用于常見病原微生物的鑒定及同源性分析，同時也探索了其他遺傳標(biāo)記在鑒定和同源性分析中的作用。
　　材料方法：
　　首先，為優(yōu)化FTA卡作為DNA模板制備的條件，以金黃色葡萄球菌菌株為樣品，將不同濃度菌液滴在 FTA卡上，并用打孔器打出不同直徑卡片，分別進(jìn)行熒光 PCR-16S rDNA測序，

3、根據(jù)熒光PCR的Cp值和測序結(jié)果優(yōu)化最合適的FTA卡制備DNA模板條件。其次，為了對比本實驗方法較于傳統(tǒng)Sanger測序方法而言在各方面（包括鑒定結(jié)果，操作技能要求、測序質(zhì)量，工作量，時間，費(fèi)用）是否存在優(yōu)勢，先進(jìn)行小樣本（12株菌，每種菌4個樣本，其中一個樣本為標(biāo)準(zhǔn)菌株）預(yù)實驗。再次，以銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌大樣本（各30株）為實驗對象進(jìn)行預(yù)試驗和方法驗證，建立16S rRNA基因快速測序細(xì)菌鑒定方法：用適當(dāng)濃度的

4、菌液制備FTA樣品卡，取直徑0.5mm的FTA卡，SYBR GreenⅠ熒光PCR直接擴(kuò)增法獲得16S rRNA基因片段，PCR產(chǎn)物簡單稀釋后進(jìn)行 Sanger測序，測序產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后其結(jié)果使用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站的nucleotide blast工具進(jìn)行匹配分析，獲得細(xì)菌鑒定結(jié)果。最后，為了探索其他遺傳標(biāo)記的作用，分別針對三種菌的23S-5S rRNA基因間隔區(qū)間序列自行設(shè)計特異性引物，每種菌各取4個樣本（1株

5、標(biāo)準(zhǔn)菌株和3株分離自不同臨床菌），按16S rRNA的實驗條件和方法流程進(jìn)行操作，個別步驟作了相應(yīng)的優(yōu)化。
　　結(jié)果：
　　1、采用直接擴(kuò)增法進(jìn)行SYBR Green熒光PCR反應(yīng)時，在直徑為0.5、1.0和2.0 mm的卡片中，只有0.5 mm的卡片得擴(kuò)增產(chǎn)物。6.0×104~7cfu/ml菌液制備的FTA樣品卡， SYBR Green熒光PCR擴(kuò)增的Cp值在14.8~28.2范圍內(nèi)，其測序產(chǎn)物數(shù)據(jù)較為理想。
　　2

6、、對比試驗中，12株菌株測序質(zhì)量經(jīng)量化后統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)本實驗方法稍劣于傳統(tǒng)方法。但是對這12株菌株的鑒定結(jié)果，兩種方法均一致且準(zhǔn)確。方法對比的其余指標(biāo)，如操作技巧要求、工作量、耗時、費(fèi)用等，分別為低vs高、輕松vs繁重、8h vs11h/12個樣品和$420 vs$400/12個樣品。
　　3、采用本方法進(jìn)行大樣本細(xì)菌鑒定時，所有90個樣本的目標(biāo)序列均可以測序成功。其中，所有金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均可獲得與傳統(tǒng)生化方法完全一

7、致的鑒定結(jié)
　　果，而在30株傳統(tǒng)方法鑒定為“大腸埃希氏菌”的樣本中，只有8株（26.7％）被鑒定為大腸埃希氏菌，有10株（33.3%）被鑒定為宋氏志賀氏菌，12株（40%）被鑒定為痢疾志賀氏菌。
　　4、采用本方法測定3種菌的23S-5S rRNA基因間隔區(qū)序列時，金黃色葡萄球菌與大腸埃希氏菌樣本均可獲得清晰可辨的測序結(jié)果，且比對分型結(jié)果顯示均可得到準(zhǔn)確鑒定，匹配率達(dá)到99%。但銅綠假單胞菌序列出現(xiàn)雙重片段，無法直接通過序

8、列比對獲得鑒定結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　1、6.0×104~7cfu/ml菌液制成的FTA樣品卡，打出直徑為0.5 mm卡片，適于熒光PCR-16S rRNA基因測序法鑒定細(xì)菌。
　　2、從操作技巧要求、工作量、耗時和綜合比較來說，本實驗的新組合方法優(yōu)于傳統(tǒng)測序方法。
　　3、本方法可快速、可靠、穩(wěn)定、方便地進(jìn)行16S rRNA基因測序，適用于銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的快速準(zhǔn)確鑒定，但由于無法區(qū)分大腸埃希氏菌和