微流控免疫芯片在病原菌快速檢測(cè)中的研究.pdf

1、病原菌的常規(guī)檢測(cè)包括非選擇性和選擇性培養(yǎng)、生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定等步驟,其操作繁瑣,周期長(zhǎng)(5-7d),費(fèi)時(shí)費(fèi)力,不能滿足當(dāng)代社會(huì)對(duì)環(huán)境、食品安全監(jiān)督和傳染性疾病快速診斷的需要。近年來(lái),隨著生物技術(shù)的發(fā)展而建立起來(lái)的快速檢測(cè)技術(shù)(如免疫分析技術(shù)、PCR技術(shù)等)雖然能夠在較短時(shí)間內(nèi)鑒定病原菌,但仍存在如靈敏度較低、假陽(yáng)性和假陰性率高、操作復(fù)雜、成本昂貴等缺陷,因此發(fā)展能夠準(zhǔn)確、敏感、快速地檢測(cè)病原菌的技術(shù)方法刻不容緩。
　　 微流控

2、芯片作為新出現(xiàn)的微分析技術(shù)平臺(tái),以其結(jié)構(gòu)縮微化、功能集成化、樣品和試劑耗量低、高通量輸出、分析時(shí)間短、易于便攜和自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì),近年來(lái)在微生物檢測(cè)中的發(fā)展非常迅速。但現(xiàn)有的微流控芯片微生物檢測(cè)的研究主要是針對(duì)微生物研究中的某一單元或步驟,如富集/分選、預(yù)處理或分離檢測(cè)展開(kāi)的,缺乏集樣品處理、稀少樣本富集/分選和檢測(cè)于一體的整合技術(shù)或方法,整個(gè)研究也處于起步階段。而如何將病原菌檢測(cè)各個(gè)環(huán)節(jié)的操作過(guò)程集成于一張微流控芯片上,并形成自動(dòng)化的病原

3、菌檢測(cè)系統(tǒng),是當(dāng)今微流控芯片用于病原菌檢測(cè)所面臨的挑戰(zhàn)。
　　 鑒于當(dāng)今社會(huì)對(duì)病原菌快速檢測(cè)的要求和現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的缺陷,本研究構(gòu)建了一個(gè)微流控免疫分析芯片,在芯片上開(kāi)展了病原菌的分選/富集和生物發(fā)光檢測(cè)研究。微流控芯片免疫分選技術(shù)具有抗體和試劑耗量低、反應(yīng)速度快、易于集成和實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì):而以具有納米至微米級(jí)尺寸粒徑的微珠作為抗體的固相載體,不但可以增大抗原-抗體反應(yīng)的比表面積,而且其易于填充和更換的特點(diǎn)可以使芯片各單元功能更

4、加分明,另外芯片構(gòu)型簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉,易于構(gòu)建和普及。利用ATP-螢火蟲(chóng)熒光素-蟲(chóng)熒光素酶體系的生物發(fā)光分析對(duì)微生物進(jìn)行定量,可因光子產(chǎn)生率高而達(dá)到極高的靈敏度,不需光源和復(fù)雜的光路,也無(wú)需對(duì)微生物進(jìn)行標(biāo)記,即可得到微生物數(shù)量和活性的信息,是可集成于微流控芯片上的理想檢測(cè)方法。
　　 因此,本研究以E.coli O157:H7為檢測(cè)目標(biāo),將針對(duì)該細(xì)菌的高特異性和高捕獲率的免疫微珠富集腔設(shè)計(jì)于芯片微通道中,并采用ATP生物發(fā)光體系對(duì)

5、富集到的細(xì)菌進(jìn)行在線定量分析,建立了集高特異性捕獲/富集和高靈敏度檢測(cè)為一體的病原菌快速檢測(cè)法。
　　 研究首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?設(shè)計(jì)PDMS/玻璃微流控芯片的微通道構(gòu)型和尺寸,芯片包括流體傳輸、免疫捕獲和發(fā)光檢測(cè)三個(gè)功能性區(qū)域。通過(guò)模塑法完成了芯片的制作,并對(duì)制作工藝和封接方式進(jìn)行了優(yōu)化。
　　 其次,通過(guò)對(duì)粒徑為50μm的玻璃微珠表面進(jìn)行硅烷化處理和抗E.coli O157:H7多克隆抗體的共價(jià)連接,完成了玻璃微珠的生物

6、功能化修飾。將玻璃微珠填充于芯片微通道的六邊形腔內(nèi),通過(guò)探索微珠傳輸流速和方式,構(gòu)建了一個(gè)呈單層均勻排列的芯片免疫微珠富集腔。并在熒光顯微鏡下觀察經(jīng)吖啶橙染色的Ecoli O157:H7在芯片內(nèi)的捕獲,進(jìn)而驗(yàn)證了免疫富集腔能夠有效捕獲/富集到細(xì)菌。利用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)了芯片免疫富集腔的捕獲效率,通過(guò)對(duì)芯片進(jìn)樣和沖洗的參數(shù)的優(yōu)化,使填充有免疫玻璃微珠的免疫富集腔對(duì)細(xì)菌樣品的實(shí)際捕獲率達(dá)到91.75％～95.62％。
　　 最后,

7、通過(guò)ATP-螢火蟲(chóng)熒光素.蟲(chóng)熒光素酶體系和微弱發(fā)光檢測(cè)儀實(shí)現(xiàn)了對(duì)芯片內(nèi)捕獲到的細(xì)菌的生物發(fā)光檢測(cè),并對(duì)芯片內(nèi)發(fā)光反應(yīng)的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)細(xì)菌濃度-發(fā)光強(qiáng)度回歸方程的擬合,建立了用生物發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定量的方法。對(duì)方法的線性范圍、可靠性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性進(jìn)行評(píng)價(jià),證明了該微流控芯片病原菌檢測(cè)系統(tǒng)特異性高,并能對(duì)豬肉樣品中的E.coli O157:H7進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
　　 綜上所述,本研究建立了一個(gè)特異性好、