糖尿病足感染病原菌的分布與取材及基于高通量測序技術的病原菌快速鑒定.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一章 糖尿病足創(chuàng)面感染病原菌分布及耐藥性15年變遷
　　目的：
　　探討DF創(chuàng)面感染病原菌分布特點及耐藥性變遷，指導臨床抗生素選擇，提高經(jīng)驗性抗感染治療的有效性。
　　對象及方法：
　　1.研究對象
　　收集2000年1月至2014年12月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院住院治療的580例DFI患者的病例資料，回顧性分析其一般臨床資料、創(chuàng)面棉拭子微生物培養(yǎng)及藥敏結(jié)果。58

2、0例患者均符合WHO制定的糖尿病診斷標準及IDSA制定的DFI診斷標準。
　　2.研究方法
　　(1)分組:580例DFI患者按照潰瘍PEDIS感染級別分為PEDIS2級組(96例)，PEDIS3級組（314例），PEDIS4級組（170例）;根據(jù)有無合并下肢動脈缺血和周圍神經(jīng)病變，判斷潰瘍性質(zhì)為神經(jīng)性（339例）、缺血性（48例）、混合性潰瘍（193例）;季節(jié)采用候溫法劃分，根據(jù)廣東省月平均氣溫將季節(jié)劃分為春季（2～3月）

3、、夏季（4～10月）、秋季（11～1月）3個季節(jié)。比較上述各組病原菌分布特點。并根據(jù)耐藥性變化趨勢將資料按年份分為2組:2000～2010年、2011～2014年，分析15年來DFI病原菌對不同抗生素的耐藥性變遷情況。
　　(2)統(tǒng)計分析:采用SPSS19.0版軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用Kolmogorov-Smimov test檢驗是否為正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計量資料用平均數(shù)±標準差表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（第一四

4、分位數(shù)，第三四分位數(shù)）表示。計數(shù)資料用率或構成比表示，多組間比較采用卡方檢驗。利用Logistic回歸分析DFI病原菌分布的影響因素。取P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.Logistic回歸分析結(jié)果提示DF潰瘍PEDIS感染級別(P＜0.001)及季節(jié)（P＜0.01）共同影響DFI病原菌類型。潰瘍性質(zhì)對DFI病原菌分布的影響無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2.PEDIS2級的DFI潰瘍在各季節(jié)均

5、以G+菌感染為主;PEDIS4級的DFI潰瘍在各季節(jié)均以G-菌感染占優(yōu)勢;而PEDIS3級者在春秋季以G+菌感染為主(55.3％)，夏季以G-菌感染為主(53.3％)(P＜0.05)。各個季節(jié)DFI創(chuàng)面的混合感染率均隨著PEDIS級別的增加而上升（P＜0.01）。
　　3.G+菌以葡萄球菌屬為主(44.7％)，對青霉素、氨芐西林完全耐藥，對萬古霉素、利奈唑胺100％敏感，15年來對阿莫西林/克拉維酸鉀的耐藥率由15.0％上升至48

6、.1％(P＜0.05);G-菌以腸桿菌科最常見(61.3％)，對氨芐西林耐藥率最高(91.3％)，對美羅培南最敏感(99.5％)，15年來對頭孢噻肟的耐藥率由29.2％增長至43.7％(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、對DFI患者經(jīng)驗性抗感染治療時可綜合考慮潰瘍PEDIS級別與季節(jié)因素對感染病原菌類型的影響，并結(jié)合不同類型病原菌對抗生素的敏感性特點有針對性地選擇抗生素。
　　2、15年來我院DFI病原菌隨著時間變

7、遷對多種抗生素的耐藥性較早年有升高趨勢，其中β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類尤甚。根據(jù)傷口特征合理有針對性地使用抗菌藥物，減少抗生素的濫用，對防止、延緩病原菌的耐藥性增長，提高抗感染治療的有效性有重大意義。
　　第二章 糖尿病足感染創(chuàng)面拭子及深部組織微生物培養(yǎng)結(jié)果的一致性研究
　　目的：
　　在不同感染程度DFI創(chuàng)面中比較棉拭子及深部組織標本微生物培養(yǎng)結(jié)果的一致性，評價創(chuàng)面棉拭子培養(yǎng)對DFI病原學診斷的有效性。
　　對象

8、及方法：
　　1.研究對象
　　本研究連續(xù)納入了2014年10月至2015年7月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院住院治療的56例DFI患者。56例患者均符合WHO制定的DM診斷標準及IDSA制定的DFI診斷標準。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會批準并取得了所有納入患者的知情同意書。
　　2.研究方法
　　(1)分組:按照創(chuàng)面PEDIS感染級別分為3組:2級（10例）、3級(29例)、4級(17例)。
　　(2) DFI創(chuàng)面

9、棉拭子擦拭取樣:采用Levine棉拭子擦拭法。
　　(3) DFI創(chuàng)面深部組織取樣:采用組織鉆取法。
　　(4)微生物培養(yǎng):參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行。
　　結(jié)果：
　　1.DFI創(chuàng)面棉拭子標本及深部組織標本均培養(yǎng)出81株病原菌（平均每個標本1.4株）。在不同PEDIS級別組中，2種不同取樣方法對于單一感染或混合感染的診斷均無顯著差異(P＞0.05)。
　　2.在PEDIS2級的DFI創(chuàng)面中，80.0

10、％的棉拭子標本培養(yǎng)結(jié)果與對應深部組織培養(yǎng)出的病原菌完全一致，而在PEDIS3級和4級的DFI創(chuàng)面，該比例顯著下降至31.0％及29.4％(P＜0.05)。
　　3.以深部組織培養(yǎng)結(jié)果作為金標準，評價棉拭子培養(yǎng)對DFI微生物學診斷的價值得出，棉拭子培養(yǎng)對于所有G+菌種類鑒定的敏感性均大于60％，特異性均大于80％。而在G-菌種類鑒定中，棉拭子微生物培養(yǎng)對于某些常見感染病原菌（如大腸埃希氏菌、摩根氏菌、枸櫞酸桿菌）鑒定的敏感性很低(3

11、3.3％)，另外有一些在深部組織標本中培養(yǎng)陽性的G-菌（沙雷氏菌、不動桿菌、皮氏拉斯通氏菌、抗壞血酸克魯依弗氏菌）均未在對應的棉拭子標本中分離出來。
　　結(jié)論：
　　1.創(chuàng)面棉拭子標本微生物培養(yǎng)鑒定對于指導PEDIS2級DFI患者的抗感染治療方案，具有較高的可靠性。
　　2.對于PEDIS感染級別≥3級的DFI患者而言，創(chuàng)面棉拭子標本對病原菌鑒定的可靠性顯著下降，尤其是易遺漏深部組織感染G-菌的診斷。因此，進行創(chuàng)面深部

12、組織培養(yǎng)對于該類患者的DFI病原學診斷有必要性。
　　第三章 基于高通量測序技術的糖尿病足感染病原菌快速鑒定及皮膚菌群多樣性研究
　　目的：
　　驗證基于PGM平臺的16S rRNA基因高通量測序技術在DFI病原菌快速鑒定中的可行性。并利用該技術比較DFI創(chuàng)面棉拭子標本及深部組織標本的微生物學檢測結(jié)果。同時，分析皮膚表面與DFI創(chuàng)面菌群結(jié)構的差異性，探討創(chuàng)面中占主導作用的致病菌，推測皮膚微生態(tài)中可能的益生菌。
　

13、　對象及方法：
　　1.研究對象
　　納入2015年1月至2015年7月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院住院治療的10例DFI患者。10例患者均符合WHO制定的DM診斷標準及IDSA制定的DFI診斷標準。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會批準并取得了所有納入患者的知情同意書。
　　2.研究方法
　　(1)標本取材方法:DFI創(chuàng)面拭子擦拭取樣采用Levine棉拭子擦拭法(S組，編號為SI、S2...S9、S10）;DFI創(chuàng)面深部組織

14、取樣采用組織鉆取法（T組，編號為T1、T2...T9、T10）;皮膚表面微生物取樣采用無菌棉拭子擦拭法（C組，編號為C1、C2...C9、C10）。
　　(2)傳統(tǒng)細菌培養(yǎng):參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行。
　　(3)基因組DNA的提取與檢測:采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒對所有標本進行基因組DNA提取。
　　結(jié)果：
　　1.通過16SrRNA基因高通量測序檢測到的菌屬種類（平均每個樣本66.

15、1種）顯著多于傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)檢測到的菌屬種類（平均每個樣本1.5種）(P＜0.001)，且測序結(jié)果分析得出的菌群中均包含了傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)鑒定得出的病原菌。然而，80％傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)結(jié)果與測序診斷的優(yōu)勢菌群（豐度最高）不一致。
　　2.基于測序結(jié)果進行Alpha多樣性分析，結(jié)果顯示: C組OTU數(shù)量、菌屬數(shù)量及香農(nóng)指數(shù)均顯著高于T組及S組(P＜0.001)，而S組與T組之間的OTU數(shù)量、菌屬數(shù)量及香農(nóng)指數(shù)均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。<

16、br>　　3.基于測序結(jié)果進行Beta多樣性分析，Venn圖提示，C組與T組之間、C組與S組之間、S組與T組之間重疊的菌種序列數(shù)分別僅占11.4％、11.0％、31.0％。主成分分析顯示代表C組樣本的點與代表S組、T組的點能顯著分開。部分代表S組樣本的點與對應T組樣本的距離很近（如S1和T1），而另一部分卻明顯的分離開（如S3和T3）。
　　結(jié)論：
　　1.基于PGM測序平臺的16S rRNA基因高通量測序技術可能作為臨床D