桑椹菌核病病原菌的分離、鑒定及其拮抗性桑樹內(nèi)生菌的研究.pdf

1、桑椹菌核病俗稱白果病，根據(jù)病原及病癥的不同，將其分為三類：桑椹肥大性菌核病、桑椹縮小性菌核病及桑椹小粒性菌核病。不同類型桑椹菌核病雖然病原菌不同，但侵染循環(huán)基本一致，且病害遍布全國(guó)各地，給果桑產(chǎn)業(yè)造成極大的危害。目前，桑椹菌核病主要是采用化學(xué)農(nóng)藥和農(nóng)藝措施進(jìn)行防治。然而，農(nóng)藝措施防效甚微，化學(xué)農(nóng)藥的過量使用不僅使病原菌產(chǎn)生耐藥性，而且?guī)磙r(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、威脅桑果食用和桑葉養(yǎng)蠶等問題。因此亟需尋找新的安全、高效、環(huán)境友好生物防治方法。

2、
　　植物內(nèi)生菌廣泛分布于陸生及水生植物體內(nèi)，以植物為棲息場(chǎng)所。植物內(nèi)生菌作為新型生防因子，能定殖于健康植物的各種組織和器官中，與植物建立和諧關(guān)系，并可通過合成抗菌活性物質(zhì)、誘導(dǎo)植物抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等機(jī)制提高宿主植物抗病性。內(nèi)生菌受環(huán)境條件的影響較小，能在植物體內(nèi)長(zhǎng)期定殖和傳導(dǎo)，發(fā)揮生防作用,已經(jīng)成為植物病害生物防治中潛在的生防菌而備受重視。
　　本文從發(fā)病桑椹和子實(shí)體中分離桑椹縮小性菌核病病原菌和桑椹肥大性菌核病病原菌，

3、從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)水平進(jìn)行鑒定，并對(duì)其培養(yǎng)特性進(jìn)行研究。進(jìn)而以分離獲得的桑椹菌核病病原菌為靶標(biāo)，從健康桑樹中篩選、鑒定具有顯著而穩(wěn)定拮抗作用的內(nèi)生菌。并研究?jī)?nèi)生拮抗菌對(duì)桑樹種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，為利用桑樹內(nèi)生菌進(jìn)行桑椹菌核病的生物防治奠定研究基礎(chǔ)。本研究主要取得了以下結(jié)果：
　　1.桑椹菌核病病原菌的分離、鑒定和培養(yǎng)特性研究
　　從經(jīng)表面消毒的梭狀子實(shí)體及縮小性桑椹病椹中分離病原真菌，共獲得101個(gè)分離株，12株經(jīng)IT

4、S序列分析，及形態(tài)學(xué)研究，鑒定為蠟釘菌目（Helotiales）、地舌菌科（Geoglossaceae）、核地杖菌屬（Scleromitula）、桑椹核地杖菌（Scleromitula shiraiana）。其中Scleromitula shiraiana SXSG-5分離株的田間回接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盛花期接種該菌菌絲的桑椹呈現(xiàn)出明顯的縮小性菌核病癥狀，且經(jīng)組織分離法再次獲得桑椹核地杖菌（Scleromitula shiraiana）。培養(yǎng)特

5、性研究結(jié)果表明，S.shiraiana SXSG-5能在多種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）和桑葉汁瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，在桑葉汁馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上有大量的菌絲，最適生長(zhǎng)溫度為20℃，最適pH為6.0，光照對(duì)該菌生長(zhǎng)的影響較顯著，全光照條件下菌株生長(zhǎng)最快。
　　從經(jīng)表面消毒的盤狀子實(shí)體中分離病原真菌，得到27個(gè)分離株，11株經(jīng)ITS序列測(cè)定分析，及形態(tài)學(xué)觀察，鑒定為子囊菌亞門（Ascomycotina）、錘舌菌綱（L

6、eotiomycetes）、肉膜菌目（Helotiales）、核盤菌科（Sclerotiniaceae）、核盤菌屬（Sclerotinia）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。其中，Sclerotinia sclerotiorum PZ-2分離株的回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其能引起果桑肥大性菌核病，且經(jīng)組織分離法能再次獲得核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。Sclerotinia sclerot

7、iorum PZ-2菌株的培養(yǎng)特性研究發(fā)現(xiàn)：該菌能在多種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中在PDA、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、桑葉汁馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、桑葉汁瓊脂培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)迅速，3天即可布滿90 mm平板。病原菌在20℃到25℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)最快，p H和光照條件對(duì)該菌生長(zhǎng)影響不顯著。
　　2.拮抗菌的分離、鑒定、抑菌譜測(cè)試及培養(yǎng)特性研究
　　以分離獲得的桑椹菌核病病原菌S.shiraiana SXSG-5和S.sclerotiorum PZ

8、-2為指示菌，從健康桑樹的內(nèi)生菌中篩選對(duì)其有顯著而穩(wěn)定抑制作用的菌株，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征的研究，完成拮抗菌的鑒定工作。
　　從健康實(shí)生桑莖中分離獲得一株內(nèi)生菌SAJ-1，其三周培養(yǎng)物對(duì)桑椹核地杖菌Scleromitula shiraiana SXSG-5抑菌率為98.07％，對(duì)核盤菌Sclerotinia sclerotiorum PZ-2的抑菌率為93.42%，且抑菌作用穩(wěn)定。SAJ-1菌株在PDA、WA和 OA培養(yǎng)基

9、上培養(yǎng)12周，可在培養(yǎng)基表面產(chǎn)生分生孢子器。分生孢子器呈球形、扁球形，單生或叢生，頂部突起，具孔，大小98.0～126.9μm×158.3～186.0μm；分生孢子器細(xì)胞壁角形組織狀，呈黑色或褐色。在器壁的外表面有剛毛束，剛毛長(zhǎng)30.8～93.1μm，剛毛近端細(xì)基部粗。分生孢子器破碎后可見分生孢子梗，蓮藕形，有隔膜，大小50.0～80.0μm×110.0～268.0μm，無分支；分生孢子透明，單胞，圓形或橢圓形，大小0.8～1.5μm×

10、2.3～3.1μm，且內(nèi)部無滴狀斑點(diǎn)。經(jīng)28S rDNA序列分析顯示，SAJ-1菌株與絲座殼科（Cucurbitariaceae）棘殼孢屬（Pyrenochaeta）的Pyrenochaeta unguis-hominis（GQ387621）處于同一最小分支；ITS基因序列分析，SAJ-1與Pyrenochaeta sp.（EU885415）處于同一最小分支。將菌株SAJ-1的形態(tài)學(xué)特征與P.unguis-hominis比較發(fā)現(xiàn)，菌株S

11、AJ-1與P.unguis-hominis的分生孢子器及分生孢子的形態(tài)及大小較為相似，但分生孢子梗的大小、形態(tài)和分支方式，以及菌落在OA培養(yǎng)基上的形態(tài)相差較大，且分生孢子內(nèi)部結(jié)構(gòu)相差較大。根據(jù)分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)比較分析判斷菌株 SAJ-1屬于棘殼孢屬Pyrenochaeta sp.，命名為Pyrenochaeta sp.SAJ-1。
　　Pyrenochaeta sp.SAJ-1抑菌譜測(cè)試結(jié)果表明，其對(duì)西瓜炭疽病菌(Colletr

12、ichum lagenarium)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、旋孢腔菌(Cochiobolus sativus)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、榆枯萎病菌(Ceratocystis ulmi)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、褐斑病菌(Cercospora beticola)均具有良好的抑

13、制效果。培養(yǎng)特性研究表明，Pyrenochaeta sp.SAJ-1在燕麥培養(yǎng)基（OA）、CZA和水瓊脂培養(yǎng)基（WA）上生長(zhǎng)較快，菌株的最適生長(zhǎng)溫度為25℃，最適光照條件為12光照/12黑暗交替培養(yǎng)。
　　3.拮抗菌Pyrenochaeta sp. SAJ-1對(duì)桑樹種子萌發(fā)及桑苗生長(zhǎng)的影響
　　Pyrenochaeta sp.SAJ-1對(duì)桑椹菌核病菌具有很好的拮抗作用，能否利用該菌株在田間防治桑椹菌核病，尚需探究其對(duì)桑樹生長(zhǎng)

14、的影響。故本研究通過溫室盆栽實(shí)驗(yàn)，研究不同稀釋倍數(shù)的Pyrenochaeta sp. SAJ-1菌株的菌絲體懸液、發(fā)酵上清液對(duì)桑樹種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響。
　　種子萌發(fā)研究結(jié)果表明，菌絲體100倍和500倍稀釋液處理桑樹種子時(shí)，種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均高于無菌水處理組，發(fā)芽勢(shì)分別提高40.54%和24.32%，發(fā)芽率分別提高23.91%和15.21%，其對(duì)桑樹種子的萌發(fā)具有良好的促進(jìn)作用。利用SAJ-1發(fā)酵上清液原液、100倍和5

15、00倍稀釋液處理桑樹種子時(shí)，種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均低于無菌水處理組，對(duì)桑樹種子的萌發(fā)具有抑制作用。上清10倍稀釋液處理桑樹種子時(shí)，種子發(fā)芽率與無菌水處理組基本一致。
　　Pyrenochaeta sp.SAJ-1對(duì)桑苗生長(zhǎng)影響的研究結(jié)果顯示：菌絲體原液、10倍、100倍、500倍稀釋液均能增加桑苗的根尖數(shù)、根鮮重、單株鮮重、地上部分株高和地上部分鮮重。其中以菌絲體10倍稀釋液處理效果最好，與無菌水對(duì)照組相比，根尖數(shù)、主根長(zhǎng)、根鮮重

16、、單株鮮重、地上部分株高和地上部分鮮重分別增加50.00%、27.92%、79.87%、112.76%、22.28%、141.71%。發(fā)酵上清液原液、10倍、100倍、500倍稀釋液能夠增加根的鮮重、地上部分株高和地上部分鮮重。其中以上清10倍稀釋液處理效果最好，與無菌水處理組相比，主根長(zhǎng)、根的鮮重、單株鮮重、葉片長(zhǎng)、葉片寬、地上部分株高和地上部分鮮重，分別提高3.33%、139.60%、77.89%、26.45%、52.50%、20.

17、27%、60.30%。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，Pyrenochaeta sp. SAJ-1菌株能通過產(chǎn)生IAA及溶解磷酸鈣而對(duì)宿主植物具有促生長(zhǎng)作用，定量測(cè)定結(jié)果顯示，SAJ-1菌株產(chǎn)生 IAA的能力隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先增加，后趨于平穩(wěn)，且在培養(yǎng)至12天時(shí)IAA量達(dá)到峰值為13.16μg/mL。SAJ-1菌株在無機(jī)磷平板上可形成直徑為24.83mm的透明圈。經(jīng)測(cè)定在發(fā)酵至第7天，發(fā)酵上清液中磷含量達(dá)到最大值447.91μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，

18、上清液中的有效磷含量開始減少最后趨于平穩(wěn)。
　　綜上所述，本論文分離研究了桑椹縮小性菌核病病原菌S.shira iana SXS G-5菌株和桑椹肥大性菌核病病原菌S.sclerotiorum PZ-2菌株。篩選、鑒定了一株對(duì)兩種桑椹菌核病菌均有拮抗作用的桑樹內(nèi)生菌Pyrenochaeta sp.SAJ-1菌株。該菌株對(duì)桑苗生長(zhǎng)不僅無負(fù)面影響，且對(duì)桑樹種子的萌發(fā)及桑苗生長(zhǎng)均具一定的促進(jìn)作用，本研究取得的結(jié)果為桑椹菌核病的生物防治提