慢性丙型肝炎抗病毒療效及其與NK和特異性CD8+T細(xì)胞活性的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　丙型肝炎病毒(HCV)感染易慢性化,并可進(jìn)展至肝硬化和肝癌。采用干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療可顯著改善疾病預(yù)后,但療效受病毒和宿主多種因素影響。本研究主要探討影響丙型肝炎抗病毒療效的宿主免疫相關(guān)因素,主要內(nèi)容包括:
　　1.采用peg-IFNα或普通IFNα聯(lián)合利巴韋林治療一組慢性丙型肝炎(CHC)患者,觀察抗病毒治療效果,分析影響療效的常見臨床相關(guān)因素;
　　2.探討自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)功能活性與CH

2、C患者抗病毒療效的關(guān)系;
　　3.探討特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答與CHC患者抗病毒療效的關(guān)系。
　　方法：
　　1.70例慢性丙型肝炎患者,采用peg-IFNα或普通IFNα聯(lián)合利巴韋林按基因型治療24周或48周,停藥后隨訪至少24周的患者有60例,有10例失訪。根據(jù)停藥后24周病毒學(xué)應(yīng)答結(jié)果評(píng)價(jià)治療效果(SVR和non-SVR)。在抗病毒治療前(0w)、4w、12w、24w、48w及治療結(jié)束后24w、48w分別留取血標(biāo)

3、本,分離PBMC和血清(漿)。
　　2.運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞及其亞型頻率、表面受體表達(dá)水平、細(xì)胞毒活性和分泌細(xì)胞因子的能力。
　　3.采用型特異性引物檢測患者HLA-A基因型,特異性HCV抗原肽刺激PBMC后,流式細(xì)胞術(shù)檢測特異性CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒活性和分泌細(xì)胞因子的能力。
　　4.采用GraphPadPrism軟件作圖,SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,探討丙型肝炎抗病毒療效與NK細(xì)胞和特異性CD8+

4、T細(xì)胞活性的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　一、慢性丙型肝炎患者抗病毒療效及常見臨床相關(guān)影響因素:本組60例至少隨訪到治療結(jié)束后24周的CHC患者,HCV基因1型49例,基因2或3型11例,未檢出其它基因型別。采用peg-IFNα治療50例,普通IFNα治療10例,均聯(lián)合利巴韋林。獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)50例(83.33％),非持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(non-SVR)10例(16.67%)。和non-SVR組相比,SVR組患者的早期病

5、毒學(xué)應(yīng)答(EVR)和治療結(jié)束時(shí)病毒學(xué)應(yīng)答(ETVR)率更高(P<0.05);有劑量調(diào)整患者的SVR率低于無劑量調(diào)整患者(37.50%vs90.38%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);老年患者的SVR率低于中青年患者的SVR率(57.14%vs86.79%),高病毒載量低于低病毒載量患者(81.08%vs86.96%),肝硬化低于無肝硬化患者(62.50%vs86.54%),有合并癥低于無合并癥患者(66.67%vs86.27%),普

6、通IFNα聯(lián)合利巴韋林治療低于peg-IFNα聯(lián)合利巴韋林治療的患者(60.00%vs88.00%),但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而HCV基因1型與非基因1型患者的SVR率無明顯差異。
　　二、慢性丙型肝炎患者NK細(xì)胞活性分析
　　1.CHC患者抗病毒治療前和治療后NK細(xì)胞活性的變化:①和健康對照相比,CHC患者治療前NK細(xì)胞頻率、活化性受體NKp30、NKp46、NKG2D表達(dá)水平和細(xì)胞毒活性均下降(P<0.05

7、),抑制性受體NKG2A表達(dá)水平升高(P<0.05),NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α水平也下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);②NK細(xì)胞毒活性及分泌細(xì)胞因子IFN-γ水平均與病毒載量存在負(fù)相關(guān),NK細(xì)胞活化性受體NKG2C和NKG2D表達(dá)水平均與ALT水平存在負(fù)相關(guān);③和CHC患者抗病毒治療前相比,在治療結(jié)束后NK細(xì)胞頻率、活化性受體NKp30表達(dá)水平均升高(P<0.05),NKG2C、顆粒酶B和穿孔素表達(dá)水平均下降(

8、P<0.05),而細(xì)胞因子分泌水平的變化無明顯差異。
　　2.不同基因型CHC患者NK細(xì)胞活性比較:①基因1型與非基因1型患者在治療前NK細(xì)胞活性均無明顯差異;和非基因1型患者相比,基因1型患者治療結(jié)束時(shí)NK細(xì)胞活化性受體NKG2C和顆粒酶B表達(dá)水平均較低(P<0.05);②基因1型高病毒載量與低病毒載量患者在治療前NK細(xì)胞活性均無明顯差異;和低病毒載量患者相比,高病毒載量患者在治療4w時(shí)NK細(xì)胞頻率較低(P<0.05);③和no

9、n-SVR患者病毒反彈或復(fù)發(fā)呈陽性時(shí)相比,SVR患者在治療結(jié)束后CD56dim頻率較高,CD56bright頻率則較低(P<0.05);和non-SVR患者相比,SVR患者在治療前、治療期間及治療結(jié)束后抑制性受體NKG2A表達(dá)水平均較低,而NK細(xì)胞毒活性較高,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);兩組患者NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平無明顯差異。
　　3.抗病毒治療中NK細(xì)胞活性的動(dòng)態(tài)變化:①和CHC患者抗病毒治療前相比,在治療期間NK

10、細(xì)胞及其亞型CD56dim頻率、NK細(xì)胞毒活性和分泌IFN-γ、TNF-α水平均下降,亞型CD56bright頻率、活化性受體NKp30、NKp46和抑制性受體NKG2A表達(dá)水平均升高(P<0.05);和治療結(jié)束時(shí)相比,在治療結(jié)束后CD56dim頻率和分泌IFN-γ水平均升高,CD56bright頻率和抑制性受體NKG2A表達(dá)水平均下降(P<0.05);②按療效分組比較,SVR患者和治療前相比,在治療期間NK細(xì)胞頻率下降,在治療結(jié)束后升

11、高,在治療期間活化性受體NKp46表達(dá)水平升高,在治療期間活化性受體NKG2C和細(xì)胞因子TNF-α水平均下降(P<0.05);SVR患者和治療結(jié)束時(shí)相比,在治療結(jié)束后CD56dim頻率和CD107a表達(dá)水平均升高,CD56bright頻率下降(P<0.05)。而non-SVR患者的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　三、慢性丙型肝炎患者特異性CD8+T細(xì)胞活性分析
　　1.不同治療效果HLA-A特異性CD8+T細(xì)胞活性分析:和non-S

12、VR組、慢丙肝組相比,HLA-A2型、HLA-A11型和HLA-A24型CHC患者SVR組特異性CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α水平均較高(P<0.05),HLA-A2型CHC患者SVR組顆粒酶B表達(dá)水平較低(P<0.05),但HLA-A11型和HLA-A24型CHC患者中,SVR組和non-SVR組顆粒酶B和穿孔素表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.抗病毒治療中特異性CD8+T細(xì)胞活性的動(dòng)態(tài)變化:和抗病毒治療

13、前相比,HLA-A2型、HLA-A11型和HLA-A24型CHC患者特異性CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α水平在治療結(jié)束后均升高,而顆粒酶B表達(dá)水平在治療結(jié)束后下降(P<0.05)。
　　3.特異性CD8+T細(xì)胞活性與病毒載量、ALT水平的關(guān)系:CHC患者抗病毒治療前,HLA-A2限制性Core131-140抗原肽特異性CD8+T細(xì)胞分泌TNF-α水平和HLA-A24限制性Core35-44抗原肽特異性CD8+T細(xì)

14、胞穿孔素表達(dá)水平均與病毒載量存在負(fù)相關(guān),而特異性CD8+T細(xì)胞的功能與ALT水平無關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.影響抗病毒療效的常見臨床因素包括:劑量調(diào)整、患者年齡、肝硬化、合并癥、治療方案的選擇等。
　　2.慢性丙型肝炎患者在干擾素抗病毒治療期間,NK細(xì)胞表型和功能的改變能影響抗病毒療效,而且NK細(xì)胞的表型和功能與病毒載量或ALT水平有關(guān)。
　　3.慢性丙型肝炎患者在抗病毒治療期間不同表位抗原肽特異性CD8+T細(xì)胞

15、功能的變化不完全一致;特異性CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能的改變能影響抗病毒療效,非細(xì)胞毒活性在抗病毒中起主導(dǎo)作用;特異性CD8+T細(xì)胞免疫功能低下與病毒水平有關(guān),而與ALT水平無關(guān)。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.動(dòng)態(tài)觀察慢性丙型肝炎患者行抗病毒治療前、治療期間和治療結(jié)束后的不同時(shí)間點(diǎn)NK細(xì)胞頻率及其功能活性,探討NK細(xì)胞頻率及其功能活性對慢性丙型肝炎患者抗病毒治療效果的影響。
　　2.分析慢性丙型肝炎患者抗病毒治

16、療期間及不同治療效果患者的不同表位抗原肽特異性CD8+T細(xì)胞的功能,尤其是對在我國有較高頻率的HLA-A11和HLA-A24型特異性CD8+T細(xì)胞功能的研究。
　　本研究的意義：
　　通過分析慢性丙型肝炎患者NK細(xì)胞和特異性CD8+T淋巴細(xì)胞功能活性及其與抗病毒治療的關(guān)系,從宿主免疫反應(yīng)包括天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)角度探討影響丙型肝炎自然及抗病毒轉(zhuǎn)歸的宿主因素,對進(jìn)一步認(rèn)識(shí)丙型肝炎發(fā)病機(jī)制具有理論意義;對提高丙型肝炎抗病毒療