丙型肝炎病毒特異性樹突狀細胞胞外體的制備及免疫特性研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是引起慢性肝炎的主要病原體，約80％HCV感染者發(fā)展為慢性肝炎，并與肝硬化和肝細胞肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。然而，迄今尚缺乏有效的治療措施，疫苗的研制也步履維艱。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）作為誘導固有免疫(innate immune)和適應性免疫(adaptive immune)應答的核心環(huán)節(jié)，在機體抗病毒免疫應答中發(fā)揮著重要作用，由DC

2、分泌的胞外體（dendritic cell exosome,DC-Ex）富集MHCI/II類分子、協(xié)同刺激分子、熱休克蛋白70等多種生物活性分子于一身，作為細胞功能的使者，以“特洛伊木馬”的形式將免疫活化信息傳遞給其他免疫細胞，發(fā)揮特異性免疫效應。因此，選擇性地為Ex載荷HCV抗原信息，理論上可以大大提高抗原的免疫原性，從而有效地誘導抗原特異性細胞免疫及體液免疫應答，并建立抗病毒記憶反應，這為制備HCV疫苗提供了一個新的研究策略?；谏?/p>

3、述學術(shù)假設(shè)，結(jié)合近年有關(guān)HCV研究所獲得的信息，本研究對DC-Ex的功能特性進行以下兩方面的探討：
　　1、DC-Ex制備方法的初步建立及分析鑒定
　　①DC-Ex制備方法的初步建立選用永生化的小鼠樹突狀細胞株DC2.4為研究對象，在尿酸(uric acid，UA)濃度為0.05mmol/L，0.1mmol/L，0.2mmol/L和0.3mmol/L培養(yǎng)24h條件下，收集細胞培養(yǎng)上清，捕獲ELISA法檢測Ex表面特異性標志C

4、D80、CD86的表達率，間接考量Ex產(chǎn)生的動力學水平，探索UA對DC分泌Ex的影響，為制備大量的較高純度的Ex做準備；基于Ex的大小和密度，本研究對Ex傳統(tǒng)分離方法進行改進，把超濾技術(shù)引入Ex的制備過程，即應用中空纖維器去除細胞及細胞碎片、Amicon Ultra超濾離心管壓縮體積、密度梯度超離心純化獲得DC-Ex提取物。對照組則采用傳統(tǒng)的分級分離的制備方法，比較兩種方法的優(yōu)劣。
　?、贒C-Ex的分析鑒定應用透射電鏡對DC-E

5、x提取物進行形態(tài)學鑒定，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphte-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blot進行蛋白組成分析。
　　2、HCV特異性DC-Ex誘導的免疫應答反應
　　選用HCV核心蛋白C，體外刺激DC2.4細胞株，獲得具有HCV特異性的DC-Ex；把制備的C57BL/6小鼠脾細胞懸液與HCV特異性的

6、DC-Ex共孵育。收集培養(yǎng)上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immune assay，ELISA）檢測各組培養(yǎng)上清中IL-6、IL-12及IFN-γ的水平，探討DC-Ex的呈遞免疫活化信息、誘導抗原特異性免疫反應的能力。
　　實驗結(jié)果：
　　1、尿酸是DC分泌Ex的重要調(diào)節(jié)因素，以劑量依賴方式影響Ex的產(chǎn)量，濃度為0.1mmol/L時，Ex的產(chǎn)量最高。
　　2、所建立的超濾離心法是一種簡便高效的制備E

7、x的實驗方法，獲得的DC-Ex在電鏡下呈典型的杯狀，由脂質(zhì)雙層膜包繞的扁平半球體，直徑約60-90nm，SDS-PAGE帶型和文獻報道相似，包含有主要的特征性標志物分子MHCI，MHCII，CD80和CD86，與傳統(tǒng)分離法相比，超濾離心法耗時少，產(chǎn)量和純度較高。
　　3、HCV特異性DC-Ex可有效地將免疫活化信息呈遞給脾細胞，誘導脾細胞產(chǎn)生較高水平的IL-6、IL-12、IFN-γ。
　　初步實驗結(jié)論：
　　在尿酸的