ROCK抑制劑法舒地爾對脂多糖致大鼠肺微血管內皮細胞損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、細菌性膿毒癥及其伴隨的嚴重的并發(fā)癥是臨床常見的、威脅生命的疾病。而所有這些并發(fā)癥的一個共同點就是內皮細胞損傷和功能障礙。肺微血管內皮細胞(PMVECs)是肺組織的重要實質細胞，在肺損傷過程中既是首位受損傷的靶細胞，又是活躍的炎癥細胞和效應細胞，在疾病發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。因此，深入探討PMVECs損傷機制在肺循環(huán)疾病的研究中至關重要。
　　感染尤其是革蘭氏陰性菌膿毒癥是急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)等肺循環(huán)疾病

2、的主要病因。細菌脂多糖(LPS)作為革蘭陰性桿菌外膜上的一種糖蛋白，在體內可引起強烈的炎癥反應，直接或間接損傷PMVECs，在感染性ALI/ARDS的病理過程中起關鍵作用。炎性刺激下PMVECs損傷的調控機制涉及復雜的信號轉導途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在ALI/ARDS、肺動脈高壓、肺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中均有RhoA/Rho激酶（ROCK）信號通路的參與。RhoA/ROCK通路作為體內普遍存在的一條信號通路，在細胞的信號轉導過程中起著信號轉換器或

3、分子開關的作用，能夠誘發(fā)肌動蛋白細胞骨架重排、調控基因轉錄及細胞周期進程等。然而，RhoA/ ROCK通路在LPS誘導的大鼠PMVECs損傷中的調節(jié)機制以及與其他信號通路的交叉反應尚需進一步研究。因此，本實驗以LPS誘導大鼠PMVECs損傷為模型，觀察RhoA/ROCK通路在PMVECs損傷中的變化。并通過細胞免疫化學、流式細胞術、激光共聚焦及細胞分子生物學等技術研究ROCK抑制劑法舒地爾對LPS誘導的大鼠PMVECs損傷的影響，深入探

4、討其下游信號轉導機制。
　　第一部分 RhoA/ROCK通路參與LPS誘導的大鼠肺微血管內皮細胞損傷
　　目的:研究RhoA/ROCK通路在LPS誘導的大鼠PMVECs損傷中的變化及可能機制。
　　方法:組織貼塊法原代培養(yǎng)大鼠PMVECs，Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色及透射電鏡觀察細胞超微結構鑒定大鼠PMVECs; MTT及乳酸脫氫酶(LDH)法測定PMVECs細胞活力;RT-PCR檢測RhoA、ROCK1mRNA的

5、表達;Western blot檢測MYPT1磷酸化水平。
　　結果:
　　1 PMVECs體外培養(yǎng)及鑒定
　　采用組織貼塊法并加以改良成功培養(yǎng)出大鼠PMVECs，去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)3～5天后，基本形成細胞單層，匯合呈典型的鋪路鵝卵石狀排列。Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色表明，約95％的細胞表現(xiàn)為陽性。電鏡結果表明:多數(shù)細胞均可觀察到質膜突起，即微絨毛;在細胞漿中還觀察到W-P小體;另外有大量的質膜小泡（又稱吞飲小泡）存

6、在于細胞漿內，上述結構符合典型的內皮細胞超微結構特征。結合我們的取材部位為肺外邊緣組織，因此可以證實分離培養(yǎng)的細胞的確為肺微血管內皮細胞。
　　2 LPS對大鼠PMVECs細胞生長的影響及法舒地爾的干預作用
　　MTT實驗結果表明:與對照組（OD值為0.95±0.12）相比，0.01、0.1、1μg/ml LPS對大鼠PMVECs生長沒有明顯影響;而10、100μg/ml LPS處理組OD值分別降為0.75±0.19(P＜0

7、.05)和0.50±0.12(P＜0.01)，細胞生長明顯抑制。10μg/ml LPS能明顯造成PMVECs損傷，但又不至于導致?lián)p傷過重，仍留有足夠數(shù)量的細胞進行后續(xù)實驗，因此，初步選定用10μg/ml LPS制作PMVECs損傷模型。10μg/ml LPS作用6h和12h時對細胞生長沒有明顯影響，作用24 h時OD值為0.73±0.19，與LPS作用0h（OD值為0.93±0.15）相比，PMVECs生長明顯受到抑制(P＜0.05)，

8、在48 h和72 h時，仍處于較低水平。25，50μM法舒地爾預處理對LPS作用24 h導致的細胞損傷有不同程度的改善（與LPS組相比，P＜0.05）。
　　3 LPS對大鼠PMVECsLDH活性的影響及法舒地爾的干預作用
　　對照組上清液中LDH活性為127.6±17.3 U/L，0.1、1、10、100μg/mlLPS作用24 h均不同程度地引起LDH的活性升高，分別升至155.1±23.4U/L(P＜0.05)、162

9、.3±34.3 U/L(P＜0.05)、189.1±25.1 U/L(P＜0.01)及194.7±22.7 U/L(P＜0.01)。10μg/ml LPS作用6h時LDH活性明顯升至139.7±19.2 U/L，與LPS作用0h（LDH活性114.1±21.1 U/L）相比差異顯著(P＜0.05)，隨著作用時間延長，LDH活性持續(xù)增高，說明PMVECs受損越來越嚴重。不同濃度（10，25，50μM）法舒地爾預處理組上清液中LDH活性均有

10、不同程度地下降(P＜0.05或P＜0.01)，進一步說明法舒地爾在一定程度上減少了LDH的釋放，改善了LPS誘導的PMVECs損傷。
　　4 LPS誘導的PMVECs損傷中RhoA、ROCK1 mRNA表達的變化
　　與對照組(LPS0 min)相比，10μg/ml LPS作用15 min即開始明顯誘導大鼠PMVECs中RhoA mRNA的表達(P＜0.05)，作用5 min即明顯誘導ROCK1 mRNA的表達(P＜0.05

11、)。隨著作用時間的延長，RhoA、ROCK1 mRNA的表達逐漸升高，RhoA mRNA的表達在LPS作用60 min時達到最高(P＜0.01)，ROCK1mRNA的表達在LPS作用15 min和60 min時出現(xiàn)兩次表達高峰(P＜0.01)。隨后，RhoA、ROCK1 mRNA的表達雖有所下降，但直到240 min仍顯著高于對照組(LPS0 min)(P＜0.O1)。表明RhoA/ROCK信號通路可能參與了LPS誘導的大鼠PMVECs

12、損傷。
　　5 LPS對PMVECs中MYPT1磷酸化水平的影響及法舒地爾的干預作用
　　ROCK活化后，進一步磷酸化其下游底物MYPT1，因此，MYPT1磷酸化水平的高低反映了ROCK的活化程度。Western blot結果顯示，10μg/ml LPS在作用5 min即明顯誘導了大鼠PMVECs中p-MYPT1的表達（P＜0.05），且在15 min時MYPT1磷酸化水平達到最高(P＜0.01)。隨后，p-MYPT1的表達

13、雖有不同程度地下降，但直到120 min仍顯著高于對照組(LPS0 min)(P＜0.01)。法舒地爾10、25、50μM預處理不同程度地降低LPS作用15 min誘導的p-MYPT1的表達(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結論:本實驗成功分離和培養(yǎng)了原代大鼠PMVECs。LPS明顯誘導了大鼠PMVECs損傷，RhoA/ROCK信號通路參與了LPS誘導的大鼠PMVECs損傷。
　　第二部分法舒地爾對LPS致大鼠PMVEC

14、s凋亡、骨架重排的影響及機制研究
　　目的:探討ROCK抑制劑法舒地爾對LPS致大鼠PMVECs凋亡及骨架重排的影響及作用機制。
　　方法:AnnexinV/PI及Hoechst33258熒光染色法檢測大鼠PMVECs凋亡;F-actin免疫熒光染色觀察PMVECs骨架結構的改變;Western blot檢測ERK1/2、JNK1/2/3、p38的磷酸化水平以及Bax、Bcl-2凋亡相關蛋白的表達。
　　結果:

15、　　1法舒地爾對LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡的影響
　　1.1 LPS作用不同時間對大鼠PMVECs凋亡的影響
　　結果顯示:10μg/ml LPS作用6h對凋亡沒有明顯影響。與對照組(LPS0h，早期和晚期凋亡率分別為3.1±0.7％和1.0±0.3％)相比，LPS作用12、24、48、72 h各時間點的早期凋亡率分別增至15.1±3.8％(P＜0.01)，24.3±3.6％(P＜0.01)，34.8±4.5％(P＜0

16、.01)和43.2±8.2％（P＜0.01）。晚期凋亡率分別增至2.1±0.9％(P＜0.05)，9.6±2.1％（P＜0.01），12.2±4.7％（P＜0.01），29.1±7.4％(P＜0.01)，均有不同程度的增加，說明LPS明顯誘導了大鼠PMVECs凋亡。
　　1.2法舒地爾明顯降低了LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡
　　與對照組（早期和晚期凋亡率分別為2.1±0.7％和3.0±0.7％）相比，LPS作用24 h早

17、期和晚期凋亡率分別增至37.8±8.1％(P＜0.01)和10.7±2.6％(P＜0.01)。10，25和50μM法舒地爾預處理明顯降低了LPS誘導的PMVECs凋亡，早期凋亡率分別降至27.7±4.6％(P＜0.05)，21.8±5.9％(P＜0.01)和18.6±3.9％(P＜0.01);而晚期凋亡率分別降至7.5±1.3％(P＜0.05)，6.4±1.3％(P＜0.05)和5.3±1.4％（P＜0.01），與LPS組相比差異顯著，

18、說明法舒地爾明顯干預了LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡。
　　1.3法舒地爾改善了LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡形態(tài)的改變
　　采用Hoechst33258染色觀察了PMVECs凋亡的形態(tài)學改變。結果可見，正常對照組細胞核呈較規(guī)整的圓形或橢圓形，邊緣整齊，呈彌漫均勻的低強度藍色熒光，無明顯的調亡細胞;10μg/ml LPS處理24 h后，細胞核致密濃染，核固縮，呈月牙形，并呈高亮度熒光，部分核染色質高度凝聚、邊緣化，表明L

19、PS明顯誘導了PMVECs凋亡。10，25和50μM法舒地爾干預后核濃染、固縮等具有明顯凋亡形態(tài)的細胞與LPS組相比均有不同程度的減少，進一步說明法舒地爾能明顯干預LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡。
　　1.4法舒地爾對凋亡相關蛋白Bax和Bel-2表達的影響
　　與對照組相比，10μg/ml LPS作用24 h明顯上調了Bax的蛋白表達(P＜0.01)，同時也顯著降低了Bcl-2的蛋白表達(P＜0.01)。而不同濃度(10

20、，25，50μM)的法舒地爾預處理明顯逆轉了LPS誘導的Bax和Bcl-2的表達失衡情況，不同程度的抑制了Bax的表達，升高了Bcl-2的表達(P＜0.05或P＜0.01)，表明法舒地爾可能通過調節(jié)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表達抑制LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡。
　　2法舒地爾對PMVECs骨架蛋白F-actin分布的影響
　　正常對照組可見少量的肌動蛋白纖維絲，主要分布在細胞周邊，且線條完整連續(xù)。10μg/ml LPS處

21、理后，胞漿F-actin纖維絲明顯增多，大多沿細胞呈縱軸排列。細胞周邊的F-actin逐漸斷裂消失，胞漿中出現(xiàn)密集的束狀應力纖維。且隨著LPS作用時間的延長，F(xiàn)-actin在細胞內雜亂無章、彌散分布，甚至細胞間失去正常連接結構。而在預處理了ROCK抑制劑法舒地爾（10，25，50μM）的細胞中，LPS誘導的PMVECs應力纖維形成和細胞骨架形態(tài)改變的現(xiàn)象均被不同程度地抑制，F(xiàn)-actin表達及熒光強度也明顯減弱，說明法舒地爾能明顯抑制L

22、PS誘導的PMVECs骨架結構的改變。
　　3法舒地爾對LPS誘導的大鼠PMVECs中MAPKs活化的影響
　　LPS（10μg/ml）在作用15 min時即開始明顯誘導大鼠PMVECs中ERK1/2磷酸化水平明顯升高，且在60 min時ERK1/2磷酸化水平達到最高。相同實驗條件下，預先加入不同濃度的法舒地爾預處理，并沒有改變LPS誘導的ERK1/2磷酸化水平的升高，說明在LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡中ERK1/2并不

23、是RhoA/ROCK的下游信號。另外，從JNK1/2/3及p38 MAPKs的活化程度來看，LPS（10μg/ml）在作用5 min時即開始明顯誘導大鼠PMVECs中JNK1/2/3及p38磷酸化水平增高，且在30 min時二者的磷酸化水平均達到最高。相同實驗條件下，預先加入不同濃度（10，25，50μM）的法舒地爾預處理，均不同程度地抑制了LPS作用30 min誘導的JNK1/2/3及p38磷酸化水平的增高(P＜0.05或P＜0.01

24、)。說明JNK1/2/3及p38可能作為RhoA/ROCK的下游信號分子參與了LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡。
　　4 JNK和p38 MAPKs的活化參與了LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡
　　為進一步闡明JNK和p38的活化參與了LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡。我們在接下來的實驗中觀察了SB203580(p38抑制劑)以及SP600125（JNK抑制劑）對LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響。SB

25、203580(10μM)、SP600125(20μM)預處理分別明顯抑制了LPS誘導的p38和JNK1/2/3磷酸化水平的增高(P＜0.01)，說明SP600125和SB203580能分別起到抑制JNK1/2/3和p38 MAPKs活化的作用。凋亡檢測結果表明，SB203580和SP600125預處理明顯抑制了LPS誘導的PMVECs凋亡，早期和晚期凋亡率有不同程度下降(P＜0.05或P＜0.01)。同時，SB203580及SP6001

26、25預處理還明顯逆轉了LPS誘導的凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達失衡情況，抑制了Bax的表達，升高了Bcl-2的表達(P＜0.01)，進一步說明JNK和p38的活化參與了LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡。
　　結論:JNK1/2/3和p38 MAPKs作為ROCK的下游信號分子參與了LPS誘導的大鼠PMVECs凋亡。法舒地爾作為唯一在臨床應用的ROCK抑制劑，明顯干預了LPS誘導的凋亡、骨架蛋白重排等細胞損傷，這一保護作用與

27、其抑制ROCK通路及其下游JNK1/2/3和p38 MAPKs信號分子活化有關。
　　第三部分法舒地爾對LPS誘導的大鼠PMVECs炎性因子表達的影響及機制研究
　　目的:研究法舒地爾對LPS誘導的大鼠PMVECs炎性因子表達的影響，并從氧化損傷角度出發(fā)探討其作用機制。
　　方法:RT-PCR檢測IL-6、TNF-α及MCP-1 mRNA的表達;ELISA法檢測上清液中IL-6和MCP-1的含量;激光共聚焦檢測PMVE

28、Cs中ROS的產生;試劑盒測定PMVECs中SOD、GSH-PX活力及MDA含量;Westernblot法測定PMVECs全蛋白及核蛋白中NF-κBp65的表達。
　　結果:
　　1法舒地爾對PMVECs中IL-6、TNF-α及MCP-1 mRNA表達的影響
　　與對照組(LPS0h)相比，10μg/ml LPS在作用3h時IL-6和MCP-1mRNA的表達即開始明顯升高(P＜0.01)，6h時MCP-1 mRNA表達

29、水平達到最高，12 h時IL-6 mRNA表達水平達到最高，一直到48h，IL-6和MCP-1 mRNA仍處于高表達水平(P＜0.01)。10、25、50μM的法舒地爾預處理，均明顯抑制了LPS作用12h誘導的IL-6 mRNA的表達(P＜0.01)，也不同程度地抑制了LPS作用6h誘導的MCP-1 mRNA的表達(P＜0.05或P＜0.01)。然而，LPS對TNF-α mRNA的表達沒有明顯影響。
　　2法舒地爾對LPS誘導大鼠

30、PMVECs分泌IL-6及MCP-1的影響
　　與對照組(LPS0 h，IL-6和MCP-1的分泌量分別為475±76 pg/ml、1.082±0.389μg/ml)相比，LPS在作用3h時IL-6蛋白分泌量即開始明顯升高(P＜0.05)，12h時分泌量達最高（1098±81 pg/ml，P＜0.01），一直到48 h仍處于較高水平(P＜0.01)。而MCP-1分泌量在LPS作用3、6、12h分別升至1.988±0.017μg/m

31、l(P＜0.05)、2.026±0.066μg/ml(P＜0.05)、2.038±0.072μg/ml(P＜0.05)。而且，LPS處理不同時間組與相應各時間點的對照組相比，IL-6和MCP-1蛋白分泌量均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。10、25、50μM的法舒地爾預處理，均不同程度地降低了LPS作用不同時間點誘導的IL-6和MCP-1的蛋白分泌水平(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3 LPS誘導的大鼠PMVECs中

32、ROS的生成及法舒地爾對此的影響
　　與對照組(LPS0 h)相比，10μg/ml的LPS作用從3h到48 h，熒光強度均不同程度地增強(P＜0.01)，表明細胞內活性氧生成量明顯升高，其中LPS處理6h時熒光強度達最高水平，12h時仍維持在接近于最高水平，隨后各時間點(LPS處理24 h和48 h)熒光強度有所減弱，但仍明顯高于對照組(P＜0.01)。與LPS作用6h組相比，10，25，50μM的法舒地爾預處理組，細胞內熒光強度

33、均明顯降低(P＜0.01)，說明法舒地爾明顯抑制了LPS誘導的PMVECs內ROS的生成。
　　4法舒地爾對PMVECs中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的影響
　　與對照組(LPS0 h)相比，10μg/ml LPS作用3、6、12、24、48 h各時間點組，SOD活性均表現(xiàn)出不同程度的下降(P＜0.05或P＜0.01)，其中，LPS作用12h組SOD活性降至最低。而GSH-PX活性在LPS作用6h時即開始有所下降(P

34、＜0.05)，LPS作用12、24和48 h時GSH-PX活性均處于較低水平(P＜0.01)。相反，MDA的含量隨著LPS作用時間的延長明顯升高，在LPS作用6h時即開始明顯升高(P＜0.01)，12h時達最高值，一直到48h，仍處于較高水平。而10，25，50μM法舒地爾預處理均不同程度地逆轉了LPS作用12 h誘導的PMVECs中SOD和GSH-PX活性的降低(P＜0.05或P＜0.01);同時也不同程度地降低了MDA的含量(P＜0

35、.05或P＜0.01)。
　　5法舒地爾對LPS作用下大鼠PMVECs中NF-κB p65核轉位的影響
　　與對照組(LPS0 h)相比，在LPS作用不同時間點，全蛋白中NF-κB p65的蛋白表達沒有明顯變化。而PMVECs細胞核內NF-κB p65的蛋白表達水平在LPS作用3h即明顯升高(P＜0.01)，12h時表達水平最高，直到48 h仍有較高的表達水平(P＜0.01)。10，25，50μM法舒地爾預處理均明顯降低了細

36、胞核內NF-κB p65的蛋白表達(P＜0.01)，推測法舒地爾可能通過抑制NF-κB p65核轉位從而降低了LPS誘導的炎性因子的表達。
　　6 N-acetylcysteine對LPS作用下大鼠PMVECs中IL-6、MCP-1 mRNA表達及NF-kB p65核轉位的影響
　　5、10 mM N-acetylcysteine均不同程度地降低了LPS作用12h誘導的細胞核內NF-kB p65的蛋白表達(P＜0.05或P＜

37、0.01)，對LPS誘導的NF-kBp65核轉位有一定的抑制作用。同時，5、10 mM N-acetylcysteine還明顯降低了LPS誘導的IL-6和MCP-1 mRNA的表達(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結論:(1) LPS作用下大鼠PMVECs中ROS的生成增多，炎性因子IL-6和MCP-1的表達升高。ROS抑制劑N-acetylcysteine明顯抑制了LPS誘導的NF-κB核轉位以及炎性因子的表達，表明ROS信