艾地苯醌對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述：
　　第一部分 艾地苯醌對氧化型低密度脂蛋白誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用
　　目的：
　　探討艾地苯醌對氧化型低密度脂蛋白誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響。
　　方法：
　　1.人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和鑒定。
　　2.觀察oxLDL對臍靜脈內(nèi)皮細胞的損傷以及艾地苯醌的作用。
　　結(jié)果：
　　1.在共聚焦顯微鏡下觀察培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞FactorⅧ Relat

2、ed Antigen及CD31高表達，證實所培養(yǎng)的細胞是血管內(nèi)皮細胞。
　　2.與正常組比較，100μg/ml oxLDL培養(yǎng)內(nèi)皮細胞可見細胞胞體縮小、皺縮，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細胞表面出現(xiàn)黑色顆粒，核膜模糊，較多的細胞變圓脫落，有細胞破碎，未脫落細胞收縮變小，多有細長突起相互牽連，出現(xiàn)凋亡改變，細胞增殖水平明顯下降(65.85±4.25％)(P＜0.01)。與oxLDL組比較，0.05μM，0.1μM，0.2μM艾地苯醌預處理組+10

3、0μg/ml oxLDL各組HUVECs細胞形態(tài)明顯改善，皺縮及懸浮細胞明顯減少，各組的細胞增殖水平明顯提高(分別是75.68±2.59％，78.24±2.12％，81.48±2.39％)(P＜0.05)。
　　3.各組細胞經(jīng)Hoechst33258染色后，oxLDL誘導HUVECs細胞核凋亡，有的細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光，有的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體，細胞凋亡率明顯增加(P＜0.01)。與oxLDL組相比，艾

4、地苯醌預處理的HUVEC細胞中細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細胞數(shù)明顯減少，大部分細胞染色質(zhì)呈彌漫均勻低強度熒光，細胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)。
　　4.與正常組相比，100μg/ml oxLDL組HUVECs Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax蛋白表達明顯增高，cleaved caspase-3表達明顯增高(P＜0.01)。與oxLDL組比較，0.05μm、0.1μm、0.2μm艾地苯醌預處理+100μg/m

5、l oxLDL組HUVECs Bcl-2蛋白表達水平明顯增高，Bax蛋白、cleaved caspase-3蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)。提示艾地苯醌可以通過穩(wěn)定Bcl-2，抑制Bax、cleaved caspase-3蛋白表達，抑制細胞凋亡，保護受損的血管內(nèi)皮細胞。
　　結(jié)論：
　　在體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，艾地苯醌預處理在一定的濃度下，能夠明顯抑制氧化型低密度脂蛋白誘導細胞凋亡，其可以通過穩(wěn)定Bcl-2，抑

6、制Bax、cleaved caspase-3表達，抑制細胞凋亡，保護受損的血管內(nèi)皮細胞。
　　第二部分 艾地苯醌對氧化型低密度脂蛋白誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護機制研究
　　目的：
　　研究艾地苯醌對氧化型低密度脂蛋白誘導的早期血管內(nèi)皮細胞功能障礙的保護機制，探討GSK3β、β-catenin蛋白在此過程中作用。
　　方法：
　　1.研究艾地苯醌對線粒體功能的影響。
　　2.研究艾地苯醌對GSK3β、

7、β-catenin信號蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　1.與正常組相比，100μg/ml oxLDL組內(nèi)皮細胞生成MDA量顯著增高(3.34±0.23 nmol/mg protein vs1.48±0.14 nmol/mg protein)，SOD活力顯著降低(2.12±0.18 unit/mg protein vs4.36±0.31 unit/mg protein)(P＜0.01)。
　　與100μg/ml oxLDL

8、組相比，0.05μM、0.1μM、0.2μM的艾地苯醌預處理+100μg/ml oxLDL的各組MDA生成量均明顯降低(分別是2.72±0.28 nmol/mgprotein，2.41±0.15 nmol/mg protein,2.26±0.13 nmol/mg protein)，SOD活力均明顯增高(分別是3.05±0.25 unit/mg protein，3.33±0.23 unit/mg protein，3.59±0.21 uni

9、t/mgprotein)(P＜0.01)，提示艾地苯醌可以通過抑制細胞脂質(zhì)過氧化，增強細胞清除氧自由基能力，保護oxLDL損傷的血管內(nèi)皮細胞。
　　2.與正常細胞組相比，oxLDL組紅色熒光(JC-1聚合體)明顯減弱，紅綠熒光比值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01），間接反映線粒體膜電位△Ψm顯著降低。與100μg/ml oxLDL組內(nèi)皮細胞相比，加用0.05μM、0.1μM、0.2μM的艾地苯醌預處理+100μg/ml o

10、xLDL的各組紅色熒光強度明顯增加，紅綠熒光比值顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　與正常組相比，100μg/ml oxLDL組血管內(nèi)皮細胞ATP水平顯著降低(8.83±1.71μmol/mg protein vs23.82±3.43μmol/mg protein)(P＜0.01)。與100μg/mloxLDL組血管內(nèi)皮細胞比較，0.05μM、0.1μM、0.2μM終濃度的艾地苯醌+oxLDL100μg/ml組內(nèi)皮細

11、胞ATP水平均明顯升高(分別為15.16±2.19μmol/mgprotein，16.37±3.51μmol/mg protein，17.12±2.06μmol/mg protein)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　與正常組相比，100μg/ml oxLDL組HUVECs線粒體細胞色素C蛋白表達水平明顯降低，胞漿細胞色素C蛋白表達水平明顯增高(P＜0.01），提示細胞色素C從細胞線粒體中釋放到細胞漿中，說明oxLDL通過細

12、胞線粒體凋亡通路引起細胞凋亡。與oxLDL組比較，分別用0.05μM、0.1μM、0.2μM的艾地苯醌預處理2小時+100μ g/ml oxLDL組，線粒體細胞色素C蛋白表達水平明顯增高，胞漿細胞色素C蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)。
　　3.與正常組比較，100μg/ml oxLDL組的P-GSK3β(Ser9)明顯降低，上調(diào)GSK3β活性，使P-β-catenin(Ser33/37/Thr41)含量明顯增加，胞漿β-ca

13、tenin蛋白表達水平明顯增加，胞核β-catenin蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05），影響GSK3β、β-catenin通路的信號傳導，促進細胞凋亡。與100μg/ml oxLDL組比較，0.2μM艾地苯醌+100μg/ml oxLDL組的P-GSK3β(Ser9)蛋白表達水平明顯增加，使GSK3β失活，P-β-Catenin(Ser33/37/Thr41)蛋白表達水平明顯降低，同時伴隨著胞漿β-catenin蛋白表達明顯降低和胞

14、核β-catenin蛋白表達水平明顯增加，使β-catenin核內(nèi)聚集(P＜0.05)。與10mM LiCL處理做為陽性對照一致，β-catenin核內(nèi)聚集與GSK3β的活性有關。四組之間比較細胞的總蛋白的GSK3β、β-catenin蛋白表達水平無明顯差異(P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，艾地苯醌通過抑制oxLDL誘導的細胞脂質(zhì)過氧化，增強細胞清除氧自由基能力，抑制細胞氧化應激反應。<

15、br>　　2.早期艾地苯醌干預通過改善氧化型低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的線粒體膜電位下降，增加細胞ATP生成量，改善線粒體功能，抑制血管內(nèi)皮細胞的線粒體凋亡通路，抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡。
　　3.早期艾地苯醌干預可以使P-GSK3β(Ser9)明顯增加，使GSK3β失活，失活的GSK3β影響下游β-catenin的磷酸化，P-β-Catenin(Ser33/37/Thr41)含量降低，促進β-catenin從細胞漿向細