低劑量放療誘導(dǎo)宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化分子機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 惡性腫瘤嚴(yán)重危害著人類的健康，其中宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率位居第二，死亡率位居第五。全世界每年約有50萬(wàn)新發(fā)病例，其中約30萬(wàn)的患者死于宮頸癌，在我國(guó)宮頸癌發(fā)病率居世界第二位，嚴(yán)重危害女性健康。目前，治療宮頸癌的方法主要有手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療，根據(jù)2010 NCCN宮頸癌臨床實(shí)踐指南，放療是治療宮頸癌的重要手段之一，其適應(yīng)癥廣泛，除嚴(yán)重的肝腎功能，造血功能障

2、礙外，Ⅰ～Ⅳ期患者均可進(jìn)行放射治療，尤其對(duì)于晚期、復(fù)發(fā)或者無(wú)法手術(shù)的患者，放射治療是治療的重要方法。然而由于個(gè)體體質(zhì)的差異以及腫瘤的異質(zhì)性，不同患者對(duì)放射治療的反應(yīng)不同，存在著放療敏感性和放療耐受性的差異，放療后達(dá)到治療效果也不一樣，放療耐受是宮頸癌治療失敗而出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因之一。因此，闡明宮頸癌放療耐受性的機(jī)制將有望為設(shè)計(jì)宮頸癌的個(gè)體化治療提供理論基礎(chǔ)，也將為開發(fā)逆轉(zhuǎn)宮頸癌放療耐受的治療手段提供新的思路。
　　 在腫瘤微

3、環(huán)境中，許多因素影響腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的反應(yīng)。離子放射激活與細(xì)胞凋亡，DNA損傷修復(fù)，細(xì)胞粘附和血管新生信號(hào)通路相關(guān)的一系列基因，反過(guò)來(lái)，這些基因又調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的放療反應(yīng)，影響放療效果。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞丟失細(xì)胞間的連接，獲得間質(zhì)特性的過(guò)程。包括細(xì)胞上皮特異性連接蛋白E-cadherin的重新分布或丟失，間質(zhì)marker N-cadherin和viment

4、in的發(fā)動(dòng)，細(xì)胞的形態(tài)改變?yōu)楠M長(zhǎng)的紡錘狀，遷移能力增強(qiáng)。EMT是上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，該過(guò)程也發(fā)生在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中。近年來(lái)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤中的作用逐漸被重視，研究報(bào)道EMT在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用。最近研究報(bào)道一些microRNA可以調(diào)控這一重要的生物學(xué)過(guò)程。
　　 MicroRNA(miRNA)是內(nèi)源基因編碼的、長(zhǎng)度約20-24個(gè)核菅酸的非編碼單鏈小RNA

5、分子。microRNA通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵的靶基因mRNA，影響分化、增殖、代謝和凋亡多種細(xì)胞過(guò)程。miRNA在腫瘤里的圖譜和在正常組織的表達(dá)圖譜不同，這類圖譜可以作為疾病分類的新的方法。miRNA對(duì)EMT有很重要的調(diào)節(jié)作用，miRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控及疾病的發(fā)生中扮演重要的角色。miRNA-200c直接作用于轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1及ZEB2的mRNA，上調(diào)腫瘤細(xì)胞系中E-cadherin的表達(dá)，從而減少EMT的發(fā)生。miR-20

6、0家族的成員(miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-141，miR-429)和miR-205表達(dá)在發(fā)生EMT的MDCK細(xì)胞中顯著下調(diào)。microRNA的下調(diào)是EMT過(guò)程的一個(gè)必要成分，已經(jīng)證實(shí)TGFβ敏感的miR-200和ZEB之間通過(guò)雙向負(fù)反饋環(huán)(double-negative feedbackloop)影響EMT。EMT在肺癌中影響miRNA的表達(dá)，并且通過(guò)EMT調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因而闡明調(diào)控腫瘤細(xì)胞

7、發(fā)生EMT過(guò)程的分子機(jī)制，明確其在惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展中的作用，并探索基于EMT的診斷方法具有重要的臨床意義。
　　 NF-κ B是在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，而且是在誘導(dǎo)EMT和維持EMT中是必不可少的。NF-κ B信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間由多個(gè)負(fù)反饋機(jī)制控制，從而使NF-κ B信號(hào)在癌細(xì)胞中保持其致癌性。microRNA對(duì)NF-κB有調(diào)節(jié)作用來(lái)調(diào)控NF-κ B調(diào)節(jié)的基因表達(dá)，影響這些基因的功能。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤m

8、iR-182過(guò)表達(dá)，直接抑制CYLD（腫瘤抑制基因）（NF-κB的負(fù)性調(diào)節(jié)子）的表達(dá)，促進(jìn)泛素結(jié)合NF-κ B信號(hào)通路成分誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)侵襲性表型。并且TGF-β誘導(dǎo)的miR-182表達(dá)可以延長(zhǎng)NF-κ B的活化時(shí)間。miR-146a在大部分胃癌表達(dá)上調(diào)，抑制GPCR（G蛋白偶聯(lián)受體）介導(dǎo)的NF-κB的激活，因而減少NF-κB調(diào)節(jié)的腫瘤促進(jìn)激酶的表達(dá)和生長(zhǎng)因子的表達(dá)。通過(guò)作用于NF-κB活化通路的一些成分，miR-146a在調(diào)節(jié)NF-

9、κB活性中起關(guān)鍵作用。miRNA與p53，NF-κ B，β-catenin通路相互作用在調(diào)節(jié)EMT和保持腫瘤干細(xì)胞中起重要作用。乳腺癌中抑制miR-448通過(guò)直接作用于特異的AT-富集序列結(jié)合蛋白-1(SATB1)的mRNA，導(dǎo)致雙調(diào)蛋白水平升高，表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)受體介導(dǎo)的Twist1表達(dá)升高，NF-κB激活，從而可以誘導(dǎo)EMT。基于這些報(bào)道，我們猜想miRNA調(diào)節(jié)NF-κ B在宮頸癌放療耐受相關(guān)EMT中起作用。
　　

10、本研究旨在闡明宮頸癌放療耐受的機(jī)制，為設(shè)計(jì)宮頸癌的個(gè)體化治療提供理論基礎(chǔ)。本課題進(jìn)行了三部分的研究:(1)建立宮頸癌放療耐受細(xì)胞株;(2)宮頸癌放療耐受細(xì)胞株EMT的發(fā)生及機(jī)制研究;(3)宮頸癌放療耐受相關(guān)miRNA的篩選及功能分析。
　　 方法:
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及2010 NCCN宮頸癌臨床實(shí)踐指南自行建立放療耐受(FIR)的細(xì)胞模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。采用低劑量持續(xù)分級(jí)放療的方法，給予2Gy/day的劑量照射宮頸癌細(xì)胞

11、株SiHa，C-33 A，5 days/week，至總劑量達(dá)到75Gy，細(xì)胞休息2周后實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期及凋亡的檢測(cè)驗(yàn)證FIR細(xì)胞是否對(duì)放療耐受。
　　 在建立FIR細(xì)胞進(jìn)行放療的過(guò)程中，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)與親本細(xì)胞相比，F(xiàn)IR細(xì)胞株發(fā)生了顯著的形態(tài)學(xué)改變，此改變符合EMT。為了證實(shí)FIR細(xì)胞株是否真F發(fā)生了EMT，我們進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了EMT的標(biāo)志蛋白E-cadherin和N-cadheri

12、n的變化。確定FIR細(xì)胞株發(fā)生EMT后，進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)在mRNA水平，western blot實(shí)驗(yàn)在蛋白水平檢測(cè)FIR細(xì)胞與親本細(xì)胞(N細(xì)胞)其他EMT marker的變化，并進(jìn)行分子機(jī)制研究。使用siRNA干擾FIR細(xì)胞中NF-κ B p65表達(dá)后，檢測(cè)EMT marker表達(dá)，研究NF-κ B p65是否參與調(diào)控低劑量放療誘導(dǎo)的宮頸癌EMT。
　　 miRNA表達(dá)譜芯片是研究miRNA的有力工具，通過(guò)對(duì)宮頸癌放療耐受細(xì)胞

13、株與親本細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜的分析，篩選出放療耐受相關(guān)的miRNA，為今后開發(fā)逆轉(zhuǎn)宮頸癌患者放療耐受的新治療手段提供新的靶標(biāo)。我們使用microRNA芯片檢測(cè)宮頸癌N細(xì)胞及FIR細(xì)胞，篩選與放療耐受相關(guān)的microRNA。合成miRNA的引物，定量PCR驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)結(jié)果，并對(duì)顯著差異的miRNA進(jìn)行功能研究，篩選放療耐受相關(guān)miRNA。合成FIR細(xì)胞表達(dá)降低的miRNA的模擬物mimicmiRNA，導(dǎo)入FIR細(xì)胞后，定量PCR和wes

14、tern blot檢測(cè)EMT marker表達(dá)變化。同時(shí)western blot檢測(cè)宮頸癌FIR細(xì)胞表達(dá)NF-κ B p65的變化;siRNA干擾FIR細(xì)胞表達(dá)的NF-κ B p65后定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示親本細(xì)胞和FIR細(xì)胞接受2Gy的X-ray照射后，F(xiàn)IR細(xì)胞克隆形成的能力比親本細(xì)胞增強(qiáng);FIR細(xì)胞倍增的時(shí)間比親本細(xì)胞長(zhǎng);接受不同劑量的X-ray照射后，F(xiàn)IR

15、細(xì)胞凋亡率低于親本細(xì)胞，說(shuō)明FIR細(xì)胞耐受放療。這些結(jié)果表明宮頸癌FIR細(xì)胞具有宮頸癌放療耐受的特點(diǎn)，宮頸癌放療耐受細(xì)胞系建立成功。
　　 在建立宮頸癌FIR細(xì)胞，對(duì)宮頸癌N細(xì)胞進(jìn)行放療的過(guò)程中，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)與親本細(xì)胞相比，F(xiàn)IR細(xì)胞株發(fā)生了顯著的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞由鋪路石樣的上皮表型變成細(xì)長(zhǎng)的間質(zhì)表型，此改變符合上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)細(xì)胞遷移和侵襲的能力增強(qiáng)。
　　 為了證實(shí)FIR細(xì)胞株是否真正發(fā)生了EMT，我們進(jìn)

16、行western blot檢測(cè)了EMT的標(biāo)志蛋白E-cadherin和N-cadherin的變化，結(jié)果顯示FIR細(xì)胞表達(dá)的E-cadherin降低，N-cadherin表達(dá)升高，從而初步證實(shí)了FIR細(xì)胞有EMT的改變。進(jìn)一步進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)在mRNA水平，western blot實(shí)驗(yàn)在蛋白水平檢測(cè)FIR細(xì)胞與親本細(xì)胞其他EMT marker的變化，發(fā)現(xiàn)上皮性marker CK-18表達(dá)降低，間質(zhì)marker vimentin表達(dá)升高。

17、使用siRNA干擾FIR細(xì)胞中p65表達(dá)后，E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin表達(dá)降低，說(shuō)明NF-κ B p65參與調(diào)控低劑量分級(jí)放療誘導(dǎo)的宮頸癌放療耐受相關(guān)EMT。
　　 microRNA芯片檢測(cè)宮頸癌親本細(xì)胞及FIR細(xì)胞，篩選與放療耐受相關(guān)的miRNA。結(jié)果顯示，在1198個(gè)microRNA探針中有20個(gè)microRNA有差異，定量PCR驗(yàn)證了芯片數(shù)據(jù)結(jié)果。合成FIR細(xì)胞表達(dá)降低的miRNA的模擬物mimic

18、miRNA，導(dǎo)入FIR細(xì)胞后，定量PCR和western blot檢測(cè)EMT marker表達(dá)變化，其中導(dǎo)入mimic miR-1236后FIR細(xì)胞表達(dá)的E-cadherin升高和N-cadherin表達(dá)降低，差異有顯著性，說(shuō)明miR-1236參與調(diào)節(jié)低劑量分級(jí)放療引起的宮頸癌放療耐受相關(guān)EMT。
　　 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FIR細(xì)胞導(dǎo)入miR-1236后NF-κ B p65的表達(dá)降低，同時(shí)使用siRNA干擾NF-κ B p65后FI

19、R細(xì)胞表達(dá)的miR-1236比對(duì)照組顯著升高，說(shuō)明miR-1236和NF-κ B p65相互調(diào)節(jié)在低劑量分級(jí)放療誘導(dǎo)的宮頸癌EMT導(dǎo)致的放療耐受中起調(diào)控作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.低劑量分級(jí)持續(xù)放療可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而發(fā)生放療耐受。
　　 2.NF-κ B p65參與調(diào)控宮頸癌放療耐受相關(guān)的EMT。
　　 3.miR-1236參與調(diào)控宮頸癌放療耐受相關(guān)的EMT。
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