核因子-κB對3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響.pdf

1、本文擬探討NF-κB對3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT1和GLUT4)的表達(dá)以及葡萄糖攝取的影響。研究內(nèi)容分為以下兩個部分： 第一章NF-κB對高糖誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)以及葡萄糖攝取的影響。 研究目的：觀察高糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT1和GLUT4)mRNA與蛋白的表達(dá)水平以及葡萄糖攝取的調(diào)節(jié)作用，并探討NF-κB對上述調(diào)節(jié)作用的影響。 研究材料與方法：

2、 1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定。 2.實驗分組取第3～6代3T3-L1前脂肪細(xì)胞進(jìn)行實驗。按照上述方法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞后，用含1％FBS的DMEM培養(yǎng)液(D-葡萄糖濃度為5.6mmol/L)同步化24小時，然后分3組進(jìn)行下列干預(yù)48小時，每24小時換相應(yīng)處理液。 A組：低葡萄糖組(Lowglucose，LG)：DMEM中D-葡萄糖濃度為5.6mmol/L。 B

3、組：高葡萄糖組(HG)：DMEM中D-葡萄糖濃度為25mmol/L。 C組：高糖+吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)組(HG+PDTC)：先用含100μmol/LPDTC的DMEM培養(yǎng)液(D-葡萄糖濃度為5.6mmol/L)處理細(xì)胞30分鐘，再用高糖DMEM培養(yǎng)液處理細(xì)胞48小時。 3.NF-κB活性檢測(n=4)。 提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白定量后，再

4、以蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)來半定量測定Phospho-NF-κBp65(Ser536)蛋白水平，以β-actin為內(nèi)參照以AlphaImager2200軟件分析電泳條帶感光密度，并進(jìn)行積分處理。 4.GLUT1和GLUT4mRNA水平的檢測(n=6。 5.GLUT1和GLUT4蛋白水平的檢測(n=4)。 6.氚標(biāo)記的脫氧葡萄糖攝取率([3H]-2-deoxyglucoseuptake，2-DG)的檢

5、測(n=6)。 7.統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組正態(tài)分布的數(shù)據(jù)或經(jīng)轉(zhuǎn)換后呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，進(jìn)行單因素的方差分析(One-wayANOVA)，兩組間比較采用最小有意義差異(leastsignificantdifference，LSD)t檢驗。顯著性水準(zhǔn)α為0.05。 實驗結(jié)果： 1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定。 3T3-L1前脂肪細(xì)胞呈貼壁生

6、長，3～4天長至瓶底70％～80％，呈梭形或多角性，細(xì)胞核居中。經(jīng)誘導(dǎo)分化6～8天后細(xì)胞變成圓形，細(xì)胞核偏于細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞漿中可見折光性強的脂滴聚集。油紅O染色鑒定可見成熟脂肪細(xì)胞胞漿內(nèi)的脂滴被染成紅色，細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色；而前脂肪細(xì)胞胞漿內(nèi)無紅色脂滴，僅見藍(lán)色細(xì)胞核。 2.各組3T3-L1脂肪細(xì)胞間NF-κB活性的比較(各數(shù)據(jù)值×10-2)。B組(41.34±1.72，P＜0.001)高于A組(24.31±2.49)，C組

7、(20.42±3.54，P＜0.001)低于B組，C組與A組之間的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.071)。 3.各組3T3-L1脂肪細(xì)胞間GLUT1mRNA和蛋白水平的比較。 4.各組3T3-L1脂肪細(xì)胞間GLUT4mRNA和蛋白水平的比較。 5.各組3T3-L1脂肪細(xì)胞間葡萄糖攝取率的比較(單位：dpm/g×103)。 (1)基礎(chǔ)葡萄糖攝取率：B組(218.78±101.61，P=0.003)低于A組(47

8、5.70±86.07)，C組(433.99±167.20，P=0.009)高于B組，C組和A組間的差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.567)。 (2)胰島素刺激葡萄糖攝取率：B組(456.03±132.33)和A組(396.78±172.31)比較有升高的趨勢，但兩組間的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.462)。C組(287.83±90.50)低于B組(P=0.049)，C組和A組間的差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.185)。 研究結(jié)論

9、： 1.在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，高濃度葡萄糖(25mmol/L)處理48小時能夠激活NF-κB，而PDTC能夠有效抑制高糖所誘導(dǎo)的NF-κB的活化。 2.在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，高糖下調(diào)GLUT1基因和蛋白的表達(dá)，并抑制基礎(chǔ)葡萄糖攝取，抑制NF-κB的活化后可逆轉(zhuǎn)上述反應(yīng)，提示NF-κB可能介導(dǎo)高糖的上述作用。 3.在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，高糖上調(diào)GLUT4基因和蛋白的表達(dá)，抑制NF-κB的活化后可逆轉(zhuǎn)上述

10、反應(yīng)，并使胰島素刺激的葡萄糖攝取降低，提示NF-κB可能介導(dǎo)高糖的上述作用，而且NF-κB可能通過上調(diào)GLUT4基因和蛋白的表達(dá)而增加胰島素刺激的葡萄糖攝取。 第二章NF-κB對TNF-α誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)以及葡萄糖攝取的影響 研究目的：觀察TNF-α對3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT1和GLUT4)mRNA與蛋白水平的表達(dá)以及葡萄糖攝取的調(diào)節(jié)作用，并探討NF-κB對此調(diào)節(jié)作用的影

11、響。 研究材料與方法： 1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定(同第一章) 2.實驗分組 取第3～6代3T3-L1前脂肪細(xì)胞進(jìn)行實驗。按照上述方法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞后，用含1％FBS的DMEM培養(yǎng)液(D-葡萄糖濃度為5.6mmol/L)同步化24小時，然后分3組進(jìn)行下列干預(yù)48小時，每24小時換相應(yīng)處理液。以下三組均以DMEM(D-葡萄糖濃度為25mmol/L)培養(yǎng)液培養(yǎng)

12、。 A組：對照組(Control)。 B組：TNF-α組(TNFα)：5nmol/LTNF-α處理細(xì)胞48小時。 C組：TNF-α+PDTC組(TNFα+PDTC)： 1.采用含100μmol/LPDTC(D-葡萄糖濃度為5.6mmol/L)處理細(xì)胞30分鐘。 2.采用含5nmol/LTNF-α處理細(xì)胞48小時。 3.NF-κB活性檢測(n=4)(同第一章) 4.GLUT1和GLU

13、T4mRNA水平的檢測(n=6)(同第一章) 5.GLUT1和GLUT4蛋白水平的檢測(n=4)(同第一章) 6.氚標(biāo)記的脫氧葡萄糖攝取率的檢測(n=6)(同第一章) 7.統(tǒng)計學(xué)分析(同第一章) 實驗結(jié)果： 1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定(同第一章)。 2.各組3T3-L1脂肪細(xì)胞間NF-κB活性的比較(各數(shù)據(jù)值×10-2)B組(71.11±5.94，P＜0.001)高于A

14、組(41.34±1.72)，C組(25.38±4.69，P=0.001)低于A組，C組低于B組(P＜0.001)。 3.各組3T3-L1脂肪細(xì)胞間GLUT1mRNA和蛋白水平的比較： 4.各組3T3-L1脂肪細(xì)胞間GLUT4mRNA和蛋白水平的比較： (1)GLUT4mRNA：B組(0.86±0.14，P＜0.001)低于A組(2.01±0.65)，C組(0.46±0.12，P＜0.001)低于A組。C組與B組比

15、較有下降的趨勢，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.100)。 (2)GLUT4蛋白(各數(shù)據(jù)值×10-2)：B組(31.63±7.18，P＜0.001)低于A組(60.69±8.44)，C組(9.52±2.95)分別低于A組(P＜0.001)和B組(P=0.001)。 5.各組3T3-L1脂肪細(xì)胞間葡萄糖攝取率的比較(單位：dpm/g×103)(1)基礎(chǔ)葡萄糖攝取率：A組(218.78±101.61)與B組(228.45±84.

16、98)差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.853)，C組(433.90±79.23)分別高于A組(P=0.001)，和B組(P=0.001)。 (2)胰島素刺激葡萄糖攝取率：B組(383.83±117.88)和A組(456.03±132.33)比較有下降的趨勢，但兩組間的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.256)。C組(162.77±46.65)分別低于A組(P＜0.001)和B組(P=0.003)。 研究結(jié)論： 1.在3T3-L

17、1脂肪細(xì)胞中，TNF--(5nmol/L)處理48小時能夠激活NF-κB，而PDTC能夠有效抑制TNF-α所誘導(dǎo)的NF-κB的活化。 2.在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，TNF-α不影響GLUT1基因和蛋白的表達(dá)以及基礎(chǔ)葡萄糖攝取，抑制NF-κB的活化后GLUT1基因和蛋白的表達(dá)以及基礎(chǔ)葡萄糖攝取均上升，提示NF-κB可能抑制GLUT1的表達(dá)以及基礎(chǔ)葡萄糖攝取。 3.在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，TNF--抑制GLUT4基因和蛋白