晚期氧化蛋白產物抑制3T3-L1前脂肪細胞分化.pdf

1、脂肪組織為體內的代謝器官，在人體的能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。過去人們一直認為它的主要功能是被動的作為體內多余脂肪的儲存?zhèn)}庫，而現(xiàn)在則認為它在代謝調節(jié)、攝食行為及免疫調節(jié)等多項生理活動中發(fā)揮著重要作用，并可分泌多種脂肪細胞因子（包括多種炎癥因子）。與其他組織不同的是，脂肪組織具有巨大的膨脹能力：一是通過前脂肪細胞的增殖分化，轉變?yōu)橛泄δ艿闹炯毎闯芍饔?；二是通過脂肪細胞體積的增大，即肥大。 前脂肪細胞分化受一系列基因調控，

2、這些基因的活性在時空上存在相互調節(jié)。過氧化物酶增殖物活化受體（PPAR）和CCAAT/增強子連接蛋白（C/EBP）家族是兩類重要的脂肪細胞分化的轉錄調節(jié)因子。C/EBP家族成員是第一個被證明在脂肪細胞分化過程中起重要作用的轉錄因子，這些轉錄因子有一個堿性轉錄激活區(qū)和一個亮氨酸拉鏈體，可形成同源或異源二聚體，通過DNA結合區(qū)結合于靶基因的調控元件。在前脂肪細胞分化誘導劑的作用下，首先是C/EBP δ和C/EBP β的表達短暫而快速的升高，

3、二者再激活PPAR γ和C/EBPα的基因表達，隨后即有大量的脂肪細胞分化的特異基因開始表達，如脂肪酸結合蛋白AP2，這些基因的表達是脂肪細胞成熟的標志。C/EBP β主要有三種亞型，即兩個轉錄活化因子LAP，一個轉錄抑制因子LIP，它們均來源于同一個mRNA。在前脂肪細胞中，由于抗成脂基因的作用，成脂基因的活性處于抑制狀態(tài)。 晚期氧化蛋白產物（AOPP）作為近年來引起重視的一類與炎癥、氧化應激密切相關的蛋白質氧化交聯(lián)產物，是1

4、996年Witko-Sarsat等首先在尿毒癥血液透析患者循環(huán)中發(fā)現(xiàn)報道的一種尿毒癥毒素，主要存在于白蛋白中，酸性條件下在340nm有特異吸收峰。它是氧化應激過程中由激活的中性粒細胞髓過氧化物酶產生的次氯酸（HClO）作用于蛋白質而形成的，在體外用次氯酸（HOCl）作用于正常人血漿或純化的人血清白蛋白（HAS）亦可得到與尿毒癥病人血漿中相似的AOPP。已證實，慢性腎功能不全患者在早期血循環(huán)中AOPP即已升高，且隨著腎功能的惡化而進行性增

5、高。AOPP被認為是慢性腎衰竭患者更為敏感的氧化應激的標志物。體外研究表明，AOPP可引起中性粒細胞及單核細胞呼吸爆發(fā)；刺激中性粒細胞合成白介素-8；刺激單核細胞合成炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子-α。血管內皮細胞在AOPP的刺激下可產生活性氧。這些資料提示AOPP不僅是氧化應激的產物，其本身也可能誘導或加重氧化應激和炎癥。因此，脂肪組織中氧化修飾的蛋白也可能影響脂肪細胞功能。 AOPP作為氧化應激的產物，其對前脂肪細胞的的分化成熟

6、是否有所影響未見報道，目前有越來越多的報道顯示前脂肪細胞能獲得吞噬特性及表達一些巨噬細胞的特異抗原如F4/80。本研究探討晚期氧化蛋白產物（AOPP）對前脂肪細胞的分化成熟的影響及機制，并觀察其是否可獲得炎性細胞的特性。本研究以體外培養(yǎng)的3T3-L1小鼠前脂肪細胞系作為脂肪細胞分化模型，發(fā)現(xiàn)AOPP可明顯抑制前脂肪細胞脂滴形成、成熟脂肪細胞標記蛋白表達，并刺激前脂肪細胞大量表達多種炎癥細胞因子和巨噬細胞的特異抗原F4/80。本研究結果可

7、能對理解衰老脂肪組織萎縮和炎癥反應有重要意義。 研究方法: 一、無內毒素AOPP的制備與鑒定。 將純化無內毒素20mg/mlMSA與40mmol/1次氯酸等體積混合，室溫放置30分鐘，制備出MSA與次氯酸摩爾比1：140的AOPP。制備的AOPP在無內毒素PBS中透析24小時，以除去游離次氯酸（每4-6小時換液一次）。用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存。20mg/mlMSA與PBS等體積混合，作為對照。A

8、OPP含量通過測定酸性條件下340nm的吸光度值，以氯胺T為標準取得。通過鱟試驗法檢測，該方法制備的AOPP無內毒素。 二、3T3-L1小鼠前脂肪細胞的培養(yǎng)及誘導分化。 3T3-L1小鼠前脂肪細胞購自美國ATCC細胞庫。細胞復蘇后用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細胞生長至完全融合2d后開始誘導分化（誘導分化第0天），即加含0.5mmol/L 3-異丁基1-甲基黃嘌呤（3-isob

9、utyl-1-methylxanthine，IBMX）、0.25μmol/L地塞米松（DEX）和10μg/ml胰島素（Insulin）的10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)48 h，換含有10 μ/ml胰島素的培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h，隨后以10%小牛血清高糖DMEM的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2d換培養(yǎng)液1次，直至第8天95%以上的細胞已經分化為成熟的脂肪細胞。實驗組在常規(guī)誘導分化的同時，分別加入不同濃度AOPP （50μg/ml、100μg/m

10、l、200μg/ml）及200μg/ml未經修飾MSA的培養(yǎng)液全程干預細胞分化過程，對照組加常規(guī)誘導劑。 三、3T3-L1脂肪細胞的鑒定。 應用油紅O染色鑒定分化成熟的3T3-L1脂肪細胞。先用1×PBS洗3次，3.7%多聚甲醛固定細胞15-20 min，PBS洗凈后盡量吸干液體，加入0.5%油紅O染液（0.5g油紅粉末溶于60%的異丙醇100ml，過濾使用）于細胞表面，室溫作用1小時，后用水洗細胞以去除多余的染料。倒置

11、顯微鏡下觀察結果，拍攝照片，鑒定脂肪細胞分化成熟。實驗各組脂肪細胞經油紅O染色后，加2ml異丙醇溶解油紅O，用分光光度計測定各孔在490nm的OD值，以此反映胞內甘油三酯含量的高低。 四、AP2、C/EBP-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α及MCP-1 mRNA水平表達的檢測。 將復蘇傳代后的3T3-L1前脂肪細胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)方法如上所述，與0、50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未經修

12、飾的MSA共同孵育，每次換液時都加入AOPP或MSA，干預整個分化過程，直至第8天加入Trizol試劑提取細胞總RNA。按試劑盒說明進行操作，RT-PCR測定：脂肪酸結合蛋白AP2、CCTTA增強子結合蛋白-alpha（C/EBP-α）、過氧化物酶體增殖物激活受體-gamma（PPAR-γ）、白介素-6 （IL-6）、 腫瘤壞死因-alpha （TNF-α）、及單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的mRNA表達的濃度效應。另外：①細胞

13、培養(yǎng)方法同前，分別在分化的第1天，2天，4天，6天，8天與200μg/mlAOPP共孵育，即AOPP對細胞的作用時間為8天、7天、6天、4天、2天。第8天提取細胞總RNA，RT-PCR測定AP2表達的時間效應。②在檢測IL-6、TNF-α、MCP-1的mRNA水平時，未處理前脂肪細胞為對照，全培培養(yǎng)至細胞生長融合即提取細胞總RNA。 五、IL-6、TNF-α及MCP-1蛋白水平表達的檢測。 細胞培養(yǎng)如前所述，對照組的前脂

14、肪細胞生長至融合時即收集其細胞上清，其余組細胞與50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未經修飾的MSA共同孵育。第8天收集細胞上清，測細胞總蛋白的濃度。ELISA試劑盒檢測，細胞總蛋白矯正。 六、AP2、C/EBP-α、PPAR-γ、C/EBP-β、C/EBP-δ、CHOP、CUGBP及F4/80蛋白水平表達的檢測。 細胞培養(yǎng)如前所述，同時與50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未

15、經修飾的MSA共同孵育。收集第3天的細胞總蛋白，Western Blotting檢測：CCTTA增強子結合蛋白-β（C/EBP-β）、CCTTA增強子結合蛋白-δ（C/EBP-δ）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、 （CUG）n triplet repeat RNA-binding protein （CUGBP）；收集第8天的細胞總蛋白，Western Blotting檢測表達于成熟

16、脂肪細胞的脂肪酸結合蛋白2（AP2）、巨噬細胞特異抗原F4/80、CCTTA增強子結合蛋白-alpha（C/EBP-α）、過氧化物酶體增殖物激活受體-gamma（PPAR-γ）。另外：①細胞培養(yǎng)方法同前，分別在分化的第0天，1天，2天，4天，6天，8天與200μg/mlAOPP共孵育，即AOPP對細胞的作用時間為8天、7天、6天、4天、2天、0天。第8天收集細胞總蛋白，Western Blotting測定AP2表達的時間效應。②細胞與2

17、00μg/ml AOPP共同孵育，分別收集12h、24h、48h、72h、96h的細胞總蛋白，Western Blotting檢測C/EBP-β、C/EBP-δ、CHOP及CUGBP的表達（CIEBP-β的表達的高低以LAP與LIP的相對比值來表示）。 七、統(tǒng)計方法。 所有數(shù)據(jù)均代表3次重復實驗的結果，以均數(shù)±標準差表示。所有統(tǒng)計由統(tǒng)計軟件SPSS 13.0完成。多個樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA，兩兩比較

18、采用LSD，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；兩樣本均數(shù)的比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結論： 本研究發(fā)現(xiàn)AOPP可抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化成熟，并刺激前脂肪細胞表達多種炎癥細胞因子；該效應可能與抑制前脂肪細胞成脂基因（C/EBP-α、PPAR-γ）的表達和上調抗成脂轉錄因子（C/EBP β-LIP、CUGBP、CHOP）的表達有關。AOPP可能參與抑制前脂肪細胞分化并促進其向炎癥樣細胞表型