亮氨酸對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪分解和瘦素信號(hào)通路的影響.pdf

1、肥胖和超重已經(jīng)成為全球性的健康問(wèn)題，最近的研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸可以通過(guò)降低食物攝入量、改善胰島素抵抗、抑制脂肪生成、促進(jìn)脂肪分解以及促進(jìn)能量消耗等途徑減輕體重。但是也有很多研究認(rèn)為亮氨酸并不能減輕體重甚至還會(huì)促進(jìn)體重增長(zhǎng)。這可能跟亮氨酸激活的mTOR通路對(duì)代謝的多重調(diào)控有關(guān)。本研究則探討亮氨酸對(duì)脂肪分解和瘦素信號(hào)通路的影響。本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了論述。
　　第一部分:亮氨酸對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖和分化的影響
　　目的:以3T

2、3-L1前脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察不同濃度的亮氨酸對(duì)其增殖和分化的影響，確定亮氨酸的合適濃度。
　　方法:MTT法測(cè)量不同濃度的亮氨酸對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖狀況的影響。IBMX、地塞米松和胰島素誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，分別在分化過(guò)程中和分化完成后用亮氨酸干預(yù)，并用油紅O染色，觀察不同濃度的亮氨酸對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化過(guò)程及分化后的3T3-L1細(xì)胞中脂滴數(shù)的影響。
　　結(jié)果:0，0.5，1，2mM的亮氨酸處理

3、3T3-L1細(xì)胞，48h后，細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異。整個(gè)分化過(guò)程中添加亮氨酸作用14d，3T3-L1細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)會(huì)隨著亮氨酸濃度的增加而減少，但是亮氨酸對(duì)分化后的3T3-L1脂肪細(xì)胞中的脂滴數(shù)并無(wú)影響。
　　結(jié)論:0-2mM的亮氨酸不影響3T3-L1細(xì)胞增殖。亮氨酸抑制分化過(guò)程中的3T3-L1細(xì)胞內(nèi)脂滴的生成，不影響分化完成脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的生成。
　　第二部分:亮氨酸對(duì)脂肪分解的影響
　　目的:在第一部分研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)

4、一步了解亮氨酸對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)影響的原因，即研究細(xì)胞內(nèi)脂肪分解相關(guān)的信號(hào)通路。
　　方法:收集細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的培養(yǎng)基，用試劑盒檢測(cè)其中的甘油含量。收集細(xì)胞，裂解提取蛋白，用Western blot的方法檢測(cè)細(xì)胞中HSL、磷酸化HSL、PLIN和PKA蛋白的變化情況。
　　結(jié)果:在分化過(guò)程中添加亮氨酸，培養(yǎng)基中的甘油含量隨亮氨酸濃度的增加而增加;分化完成后添加亮氨酸，培養(yǎng)基中的甘油含量不隨亮氨酸濃度的增加而改變

5、。
　　在分化過(guò)程中添加亮氨酸，第4天和第14天細(xì)胞中HSL蛋白和PKA蛋白的表達(dá)量不隨亮氨酸濃度的增加而改變;但磷酸化HSL蛋白的表達(dá)量隨亮氨酸濃度的增加而增加，且第14天比第4天更為明顯;細(xì)胞中PLIN蛋白的表達(dá)量隨亮氨酸濃度的增加而減少，且第14天比第4天更為明顯。
　　在分化完成后添加亮氨酸，細(xì)胞中的HSL、磷酸化HSL、PLIN和PKA蛋白的表達(dá)量都不隨亮氨酸濃度的增加而改變。
　　結(jié)論:分化過(guò)程中添加亮氨酸

6、，降低脂滴周圍環(huán)繞的PLIN蛋白，上調(diào)磷酸化HSL，促進(jìn)脂肪分解，產(chǎn)生甘油向培養(yǎng)基中分泌。但對(duì)分化完成后的細(xì)胞則無(wú)影響。
　　第三部分:亮氨酸對(duì)瘦素信號(hào)通路的影響
　　目的:在第二部分的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討亮氨酸對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞中與脂代謝密切相關(guān)的瘦素信號(hào)通路的影響。
　　方法:在3T3-L1分化的不同階段添加不同的亮氨酸進(jìn)行干預(yù)，在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Leptin、Ob-R、JA

7、K1、JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:在分化過(guò)程中添加亮氨酸，第4天和第14天細(xì)胞中Leptin、Ob-R、JAK1、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)量隨亮氨酸濃度的增加而減少，且第14天更為明顯。在分化完成后添加亮氨酸，以上蛋白的表達(dá)量不隨亮氨酸濃度的增加而改變。
　　結(jié)論:在分化過(guò)程中添加亮氨酸，由于抑制了脂肪的生成，而使其分泌的瘦素減少，其下游的通過(guò)Ob-R激活的JAK/STAT3信號(hào)通路也相應(yīng)被抑制。而